Estudio del papel funcional del ATP intravesicular en el almacenamiento y la exocitosis de catecolaminas

  1. Estévez Herrera, Judith
Dirixida por:
  1. Ricardo Borges Jurado Director
  2. José David Machado Ponce Director

Universidade de defensa: Universidad de La Laguna

Fecha de defensa: 08 de outubro de 2015

Tribunal:
  1. Jesús Pintor Presidente/a
  2. Daniel James Marcellino Secretario/a
  3. Marcial Camacho Pérez Vogal
Departamento:
  1. Medicina Física y Farmacología

Tipo: Tese

Teseo: 394636 DIALNET lock_openRIULL editor

Resumo

El ATP es transportado y co-almacenado junto a otros transmisores a altas concentraciones en probablemente todas las vesículas secretoras conocidas (Borges, 2013). En los gránulos cromafines, organelas similares a las vesículas grandes de núcleo denso (LDCV) presentes en neuronas y otras células neuroendocrinas, podría encontrarse en el orden de ¿120 mM (Kopell et al., 1982) frente a los ¿4 mM citosólicos, representanto alrededor de un 75% de la cantidad total celular (Corcoran et al., 1986). Al margen de su papel en la transmisión purinérgica, este nucleótido posee unas propiedades físico-químicas que lo hacen especial en el interior de las LCDVs y es la formación de complejos intravesiculares entre los tres componentes principales del gránulo: las catecolaminas (CA), las proteínas y el ATP (Kopell et al., 1982). Tales interacciones han sido postuladas durante muchos años para rendir cuenta a las altísimas concentraciones de las CA contenidas, entre 0,8-1 M (Montesinos et al., 2008; Albillos et al., 1997), y la estabilidad osmótica de los gránulos (Berneis, 1972; Weder and Wiegand, 1973). Todas las estrategias desarrolladas para la depleción del contenido intravesicular de nucleótidos sobre células vivas han resultado ser ineficaces. A diferencia de las CAs, cuyo contenido cuántico es fácilmente alterable por la concentración citosólica de dopamina, por ejemplo por la incubación de L-DOPA (Mosharov et al., 2003; Sombers et al., 2005; Omiatek et al., 2013; Diaz-Vera et al., 2012; Díaz-Vera et al., 2010; Montesinos et al., 2008), el ATP posee una baja tasa de recambio del ATP en las LDCVs (Corcoran et al., 1986) de forma que el contenido en purinas se opone a los cambios citosólicos que puedan ser inducidos por inhibidores del metabolismo energético, dificultando así el estudio de la falta de este componente intravesicular sobre la exocitosis, además de la vida de la célula. En este trabajo hemos empleado la interferencia de la expresión génica mediante siRNAs específicos del transportador de nucleótidos vesicular (VNUT) para explorar la repercusión sobre la acumulación y la exocitosis de CAs de las células cromafines bovinas. Las células interferidas con VNUT (VNUT-KD) exhibieron una reducción de más del 50% de la expresión del transportador, que se tradujo en una disminución de aproximadamente un 40% de ATP y adrenalina secretadas por vía exocitótica sin cambios en las CAs totales celulares ni en los incrementos de Ca2+ intracelular. El estudio de la liberación de CAs y el neuropéptido Y asociado a EGFP, expresado de forma heteróloga en un sistema a tiempo real, permitió atribuir esta disminución de la secreción a las vesículas de nueva síntesis afectadas por la carencia del VNUT, siendo las primeras en ser liberadas ante una estimulación nicotínica. Además, la incubación de las células con L-DOPA, produjo una secreción de dopamina mayor en las células control que en las VNUT-KD, datos que sugieren que los mecanismos de acumulación vesicular de CAs en células VNUT-KD son deficientes. Los registros amperométricos de las células VNUT-KD mostraron una reducción en más de dos veces la liberación de CAs en comparación con las células control. Esta diferencia no fue debida solamente a una reducción de más del 50% del contenido cuántico de CA sino que además contribuyó a un menor grado de reclutamiento de los gránulos afectados por la carencia de ATP, dada la disminución de frecuencia de eventos exocitóticos. Con estos datos llegamos a la conclusión de que el ATP intravesicular posee un papel regulador en la transmisión dada su implicación en la acumulación y la exocitosis de CAs.