Funcion de la neurotrofina-3 en el desarrollo y mantenimiento de las estructuras olfativas

Resumen

Durante el desarrollo del SN un cierto número de neuronas mueren de modo espontáneo -muerte celular programada-. La teoría neurotrófica sostiene que la supervivencia de las neuronas depende de factores de crecimiento hoy conocidos con el nombre de neurotrofinas. Actualmente se conocen cinco neurotrofinas distintas, NGF, BDNF, NT-3, NT-4/5 y NT-6 y cuatro receptores, tres de ellos -trkA, trkB y trakC- de alta afinidad para alguno de los ligandos.Su unión estimula la actividad tirosin quinasa del receptor y desencadena la respuesta que puede variar según el sistema neural y el periodo de desarrollo. Los estudios in vivo o in vitro que estudian el efecto de neurotrofinas exógenas o el bloqueo de las endógenas, las han revelado como factores de supervivencia y/o de diferenciación. El sitio y el momento de actuación se revela por sus patrones de expresión y los de sus receptores. Finalmente, el estudio de ratones mutantes ha evidenciado la existencia de interacciones cruzadas y efectos de compensación no previstos en estudios anteriores. En general, las alteraciones encontradas en el SNP de estos ratones, ratifican a las neurotrofinas como esenciales para la supervivencia neuronal. Sin embargo en el SNC esta función queda en entredicho, ya que la muerte neuronal no es relevante en la mayoría de los centros preconizados por otras aproximaciones. La muerte celular programada es un requisito esencial para la correcta morfogénesis del TN y para adecuar el tamaño de cualquier población neuronal al tamaño de su diana. Muchas células nerviosas mueren durante su fase proliferativa, pero una importante cantidad de ellas lo hacen en fases posteriores, durante la migración o la sinaptogénesis. Una vez que las conexiones sinápticas se han establecido, la muerte celular programada es muy escasa. La teoría neurotrófica preconizada por Rita Levi-Montalcini, sostiene que la supervivencia de las neuronas en desarrollo depende de la disponibilidad de una cierta cantidad de moléculas tróficas -factores neurotróficos- procedentes de las células diana, de modo que si el suministro falla la neurona muere. Los experimentos que iniciaron esta línea de investigación fueron realizados por Vicktor Hamburguer y publicados en 1934 y 1939. Se basaban en la amputación de la yema del ala de un embrión de pollo y en la colocación de una yema de ala extra en un embrión huésped. En el primer caso se observó una reducción del número de neuronas sensoriales y motoras relacionadas con la inervación del ala. En el segundo caso se incrementó el número de estas neuronas. Pronto se vió que otros tejidos podían causar efectos similares y se procedió a aislar el agente activo a partir de fuentes como el sarcoma 180, el veneno de serpiente o las glándulas salivares del ratón. Los primeros en conseguirlo fueron Stanley Cohen y R. Levi-Montalcini hacia 1956, pero la secuencia de aminoácidos del factor, que pasó a llamarse factor de crecimiento nervioso (NGF), no fué identificada hasta 1971. El descubrimiento y la obtención del NGF permitieron la realización de numerosos estudios que respaldaron la teoría neurotrófica. A través de ellos se pudieron conocer las fuentes emisoras de NGF, su modo de transporte, sus efectos sobre las células NGF-dependientes, su temporalidad y su mecanismo acción. Los experimentos de deprivación del NGF endógeno durante el desarrollo han confirmado que el NGF es un factor indispensable para la supervivencia de neuronas simpáticas inmaduras. Si el suministro de NGF se bloquea, las neuronas mueren. Los experimentos en los que se suministra NGF exógeno in vitro o in vivo indican que el NGF no solo impide la muerte espontánea de muchas neuronas sino que favorece el incremento de la talla celular y el crecimiento dendrítico y axonal. Mediante la inyección de NGF radiomarcado se demostró que el NGF es transportado retrógradamente a través de los axones simpáticos, desde las dianas periféricas hasta los somas. Sin embargo, la mayoría de las neuronas del SNC no necesitan el NGF para sobrevivir, aunque sí extractos de tejidos o proteínas secretadas en el medio de cultivo por distintos tipos celulares. Este dato hizo que muchos investigadores se centraran en la búsqueda de nuevos factores neurotróficos. En 1982 se consiguió purificar un factor neurotrófico derivado de cerebro (BDNF) químicamente similar al NGF. Más tarde se identificaron las neurotrofinas NT-3, NT4/5 y NT-6. Todos estos factores constituyen la familia de las neurotrofinas, proteínas que regulan la supervivencia, la diferenciación y la función neuronal. Actúan uniéndose a receptores tirosin quinasa específicos (Trk). Su unión estimula la actividad tirosin quinasa del receptor y desencadena diferentes respuestas biológicas, según el sistema celular que se esté considerando. Los estudios del NGF han servido de paradigma para el resto de las neurotrofinas, pero lo que hoy se sabe de estos factores supera algunos de los esquemas iniciales : 1.El número de factores neurotróficos que regulan la muerte celular en diferentes sistemas neurales es bastante limitado. 2.Estos factores no derivan solo de los tejidos diana sino también de células vecinas o de las propias neuronas. 3.Aunque todas las neurotrofinas pueden ser transportadas retrógradamente al igual que el NGF, algunas de ellas muestran también transporte anterógrado. 4.El periodo del desarrollo en el que neuronas distintas requieren un factor trófico varía. 5.La supervivencia de la mayoría de las neuronas no parece depender de un único factor sino de varios y no siempre pertenecientes a la misma familia. Estos factores pueden ser requeridos de forma simultánea o secuenciada. 6.Diferentes poblaciones de neuronas pueden responder a un mismo factor de distinta manera. Incluso, una misma neurona puede responder de distinta manera a un mismo factor en diferentes etapas de su desarrollo. 7.Cada neurotrofina puede unirse a uno o a varios receptores de una misma familia. 8.Las variaciones en la respuesta neuronal a un mismo factor parecen depender no solo del tipo de receptor implicado sino de posibles diferencias en la vía de señalización. 9.Además de prevenir la muerte neuronal y favorecer el crecimiento de la neurona, las neurotrofinas pueden influir decisivamente en su determinación y diferenciación durante el desarrollo y en la plasticidad y la función neural durante la vida adulta. Cuando se quiere investigar el papel de un factor trófico en el desarrollo de un cierto sistema, es imprescindible conocer su patrón de expresión temporal y espacial, es decir, donde y cuando se transcribe su ARNm y donde y cuando se traduce. El estudio de los patrones de expresión de las neurotrofinas y sus receptores en el SNC durante el desarrollo indica una expresión cuidadosamente regulada : La NT-3 y el BDNF se expresan en regiones de neurogénesis y diferenciación, pero mientras que el ARNm de la primera alcanza su máximo durante el periodo embrionario, el del BDNF lo hace durante el periodo postnatal. Los datos sobre la temporalidad de la expresión son importantes porque permiten predecir el proceso de desarrollo en el que interviene cada neurotrofina : La expresión de ARNm trkB y trkC, al igual que la de sus ligandos preferentes BDNF y NT-3, es generalmente más temprana y más amplia que la de trkA y su ligando NGF. Por tanto NT-3 y BDNF deben estar implicados en procesos más tempranos. En el bulbo olfatorio el modo de acción de las neurotrofinas podría ser de tipo local (autocrino/paracrino), ya que sus neuronas además de expresar NGF, BDNF y NT-3, expresan los receptores correspondientes TrKA, TrKB y TRC. El papel de las neurotrofinas en el desarrollo se ha estudiado mediante distintas aproximaciones experimentales, similares a las usadas para estudiar el NGF. Se ha visto que en unos casos actúan como factores de supervivencia neuronal, en otros promueven la diferenciación y en otros sustentan ambos papeles. Incluso y aunque de forma más restringida, pueden actuar promoviendo la proliferación de precursores neuronales. La NT-3 actúa como factor de supervivencia y también de diferenciación en las motoneuronas. El papel de las neurotrofinas como factores de proliferación parece ser más restringido. Se ha descrito que la NT-3 promueve la proliferación en células de cresta neural, y el NGF en células precursoras cromafines. Se ha de advertir que la mayoría de estos datos están referidos principàlmente al desarrollo postnatal. Los estudios sobre la etapa embrionaria están representados por estudios in vitro. Tampoco conviene perder de vista que muchas de estas investigaciones han consistido en suministrar la neurotrofina a una cierta población de células, in vitro o in vivo. O que habiendo usado un anticuerpo para bloquear la actividad de una cierta neurotrofina endógena, no se ha tenido en cuenta la reactividad cruzada con otros miembros de la misma familia. El análisis de mutantes nulos en genes de neurotrofinas o de sus receptores, evita los inconvenientes señalados y permite ver que es lo que pasa cuando una neurotrofina endógena deja de actuar y por tanto, deducir qué es lo que hace en condiciones normales. En ratón, la eliminación de cualquiera de estos genes provoca la muerte poco después del nacimiento o en las cuatro primeras semanas postnatales, pero durante el periodo de supervivencia, estos ratones presentan deficiencias específicas que revelan el papel de las neurotrofinas en el desarrollo. Hasta ahora las investigaciones se han centrado principalmente en el SNP donde cualquiera de las mutaciones estudiadas provoca pérdida de neuronas que puede llegar al 70 % Por el contrario, en el SNC de mutantes nulos el número de neuronas no varía significativamente. Este hallazgo sorprendió inicialmente, pues contradecía muchos de los datos arriba mencionados. Los mutantes TrKB-/- presentan pérdida de neuronas motoras, pero no presentan alteraciones aparentes en otros centros nerviosos donde también se expresa el receptor (médula, córtex cerebral, capa de células piramidales del hipocampo y tálamo). Es posible que la pérdida de una neurotrofina sea compensada por la acción de otras, puesto que un mismo receptor puede ser activado por varias neurotrofinas distintas. En el caso del BDNF, su receptor, TrKB, puede ser activado también por NT-3 y NT-4/5. La NT-3 puede actuar además sobre TrKA y especificamente sobre TrKC. Aunque este y otros trabajos ya citados resaltan la importancia de la edad embrionaria en la respuesta a factores de supervivencia, estudios como el arriba descrito no han sido realizados en el cerebro embrionario de ratones mutantes. Parece posible que, a diferencia de otras neurotrofinas, la carencia de NT-3 en el SNC sea difícilmente compensada, debido al mayor número de receptores neurotróficos que la NT-3 puede activar. De hecho, al menos durante el desarrollo postnatal, se observa un incremento de la muerte celular en cerebelo de los mutantes condicionales NT-3. Nuestro objetivo se centró en estudiar la función de la neurotrofina-3 como factor de supervivencia y de diferenciación neuronal durante el desarrollo de las estructuras olfativas. Usando ratones transgénicos que carecen del gen de la NT-3. Estudiando los lugares de producción y de recepción de la NT-3 y contabilizando la tasa de muerte celular en los centros de recepción. Por último hemos analizado algunas características morfológicas e inmunohistoquímicas de estos centros como indicadores de una correcta diferenciación. La esclerosis lateral amiotrófica, la enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer tienen como origen la degeneración de las neuronas motoras, dopaminérgicas de la substancia nigra y colinérgicas basales telencefálicas respectivamente. La supervivencia y el mantenimiento de muchas de estas neuronas depende de las neurotrofinas. De ahí deriva el interés social de su estudio. Pero la NT-3 en concreto, ha sido relacionada con el mantenimiento de ciertas capacidades visuales en el adulto y se ha visto además que sus niveles se incrementan en un entorno estimulante, lo que la conecta con procesos de aprendizaje. Nuestra hipótesis de partida fue que la carencia de NT-3 en ratones provoca anomalías cerebrales que afectan a la supervivencia y a la diferenciación neuronal de distintos centros nerviosos. La determinación de estas anomalías reveló el papel que la NT-3 juega en el desarrollo y mantenimiento del cerebro. RESULTADOS 1. En primer lugar nos planteamos detectar las fuentes de NT3 en base al patrón de expresión de la betagalactosidasa en ratones transgénicos heterocigóticos (NT+/-) en los que el vector lacZ ha reemplazado al exón NT-3. Para ello he realizado series histológicas de cerebros incluidos en parafina procedentes de estos de estos ratones. En total series horizontales y transversales de estadios que van desde 12.5 días embrionarios (E) a postnatal de 1 día (P1). El objetivo fue obtener los embriones homocigotos (NT-3 -/-) para poder caracterizar el fenotipo. La región de estudio fue el sistema olfativo. El porcentaje de mutantes nulos para NT-3 fue muy bajo, esto es debido a que estos embriones mueren en estadio muy temprano E13.5. 2. En paralelo hemos realizado una colección histológica completa de cerebro embrionario de ratón no transgénico, desde el estadio E12.5 hasta el E18.5, que han sido teñidas con técnicas histológicas de rutina. El objetivo ha sido el de poder disponer de series testigo que nos permitan comparar el patrón citoarquitectónico de los cerebros transgénicos y no transgénicos. 3. Algunas de estas series han sido procesadas con técnicas inmunohistoquímicas para probar la expresión de algunos marcadores moleculares en poblaciones emisoras o receptoras de NT3. Los marcadores utilizados han sido RC2 (marcador de células precursoras y glia radial temprana), NT3 (neuronas), calbindina y calretinina (proteínas de unión al calcio citoesqueléticas). El objetivo último de esta aproximación es ver si la expresión de alguno de estos marcadores se altera en los cerebros trangénicos. 4. Con el propósito de poder disponer en todo momento de una población de ratones trangénicos para nuestro estudio, he realizado cruzamientos la cepa NT3 con la cepa CD1 y he aprendido a genotipar los embriones obtenidos en los diferentes estadios. 5. Posteriormente hemos detectado la beta-galactosidasa mediante la reacción de x-gal en cerebros enteros los cuales fueron cortados al vibratomo para ver la expresión de la proteína. A su vez se hicieron técnicas de inmunohistoquímica para marcar el tracto lateral olfatorio (LOT), (NF-150 Kda, TAG-1, L1, etc). 6. Una vez obtenida la expresión de la beta-galactosidasa (y por ende, de la NT-3) en las diferentes regiones cerebrales, me he centrado en caracterizar su expresión en relación a la proyección olfativa. Las células que forman esta proyección se denominan neuronas mitrales, para caracterizar que su supervivencia depende la NT-3 hemos realizado cultivos celulares de bulbos olfatorios de estadio E14.5, periodo en el cual la proyección inerva el target. Estos culltivos se realizan en presencia y ausencia de la NT-3, también se han incluído BDNF, y NGF como control. Una vez las células han crecido, se realiza la técnica inmunológica correspondiente y se procede al recuento para ver la supervivencia y muerte celular o apoptósis. En este caso hemos utilizado como marcadores de mitrales la proteína reelin, tuj-1, Map-2. 7. La morfología de los axones con y sin neurotrofinas la hemos visto haciendo cultivo de explantes de bulbo olfatorio del mismo estadio E 14.5, comprobando la diferencia en el crecimiento y la ramificación según se añada una neurotrofina u otra. 8. Las poblaciones receptoras de NT-3 se han detectado mediante la de RT-PCR, usando los primers correspondientes para Trk C (receptor específico para NT-3) los cuales se han sintetizado específicamente para este ensayo. La región de la cual se ha obtenido el RNA de la región a estudio es la vía olfatoria. 9. En el último año empecé la caracterización del cerebro adulto, centrándonos en el estudio de NT3 en el bulbo olfatorio adulto (OB) y la zona subventricular (SEZ). Para saber si la neurotrofina tiene algún papel en la neurogénesis adulta a partir de las células madre neurales (aNSCs) que se encuentran en estas regiones. Para ello he analizado la auto-renovación, proliferación y diferenciación de las células madre neurales de la SEZ y del OB, tanto in vivo como in Vitro. 10. Hemos analizado auto-renovación de las aNSCs tanto del fenotipo salvaje como del heterocigoto (NT+/-) y con la adición de la proteína exógena a los cultivos celulares de las aNSCs de la SEZ y OB. Para ver si la proliferación del mutante se ve afectada, hemos realizado un régimen de inyecciones de BrdU (bromodeoxiuridina) a los animales. Finalmente con tinciones inmunohistoquímicas para BrdU hemos visto el cambio en la proliferación de las células madre, tanto in vivo como in Vitro. 11. Se ha analizado la diferenciación de las células madre neurales adultas y la multipotencia para ver su capacidad de dar neuronas, astrocitos y oligodendrocitos. De esta manera, vemos si la neurogénesis en el bulbo olfatorio de ve afectada. 12. Finalmente Realizamos un estudio para detectar la fuente de la neurotrofina que captan las células madre de la SEZ y del OB y que es capaz de modificar la auto-renovación y diferenciación de las mismas. CONCLUSIONES 1. La expresión de la NT-3 en el desarrollo embrionario tiene un patrón temporal y espacial específico para cada región cerebral. Su nivel de expresión varía con la edad del individuo, siendo más elevado en las estructuras que forman parte del sistema límbico (Hc, Cx y sp) y las regiones diana de las proyecciones principales del OB, entre las que se encuentran: AON, TT, DPC, Tu, Pir y Ent. 2. La síntesis de la proteína en la OC, la presencia de la proteína en las células mitrales del OB que inervan estas células y los datos obtenidos in vitro, indican que NT-3 regula la supervivencia de las neuronas de proyección del OB principal. A su vez, la disminución del volumen del OB en ausencia de NT-3 sugiere que esta proteína es necesaria para la correcta morfogénesis de esta estructura. Por otro lado, la presencia de NT-3 en células de las diferentes capas del OB indica que la molécula podría estar implicada en la supervivencia y diferenciación de otras neuronas y de células gliales, especialmente, oligodendrocitos. 3. La expresión de NT-3 en las células piramidales de la OC, indica ciertas funciones locales en el establecimiento de las conexiones y la transmisión sináptica con los axones del LOT. Incluso influir en la regulación autocrina de las propias células piramidales de corteza, ya que estas células comienzan a sintetizar la proteína desde estadios muy tempranos al tiempo que comienza el proceso de diferenciación. 4. La NT-3, es sintetizada por los endotelios, los plexos coroideos, así como algunas células del septum y actúa como un regulador natural del comportamiento de las células madre neurales adultas del nicho neurogénico de la SEZ, controlando la entrada en ciclo de estas celulas. 5. La molécula de NT-3 se comporta como un factor de nicho regulando la auto-renovación de las NSCs. Actúa específicamente en las células B manteniéndolas en un estado quiescente e inhibiendo las divisiones de tipo simétrico. Este efecto de freno en la entrada en ciclo puede suponer un punto de control esencial contra la proliferación incontrolada de las células. 6. La NT-3 interviene en el mantenimiento del potencial de las NSCs, ya que el exceso de divisiones simétricas por falta de NT-3, conduce al agotamiento de los astrocitos proliferantes provocando su conversión en astrocitos maduros. 7. La presencia de la NT-3 en los neuroblastos derivados de la SEZ que migran a través del RMS hacia el OB, indica que muy posiblemente esta molécula regula la supervivencia de estas células al igual que ocurre en determinadas neuronas del OB embrionario. 8. Los oligodendrocitos originados en la SEZ y localizados en el cuerpo calloso están regulados por la NT-3. ya que la falta de la molécula conduce a un decremento en la proliferación de estas células. Es probable por tanto, que después de un proceso de desmielinización la NT-3 contribuya a la oligodendrogénesis adulta. 9. El OB adulto contiene células NSCs locales, que cumplen las propiedades de célula madre en cuanto su capacidad de auto-renovación y el potencial de generar neuronas y células gliales. A pesar de las similitudes que comparten estas células con las localizadas en la SEZ, su actividad proliferativa está aumentada, y se dividen in vitro incluso sin factores mitogénicos, por tanto, las NSCs del OB tienen características espaciales y temporales propias de su lugar de origen. 10. NT-3 influye en el modo de división de las NSCs localizadas en el OB y la falta de la proteína acelera la división de estas células hasta producir su agotamiento a medida que avanza la edad del individuo.