Rgt1, un factor transcripcional sensible a la glucosa, que se requiere para la represión del gen hxk2 de saccharomyces cerevisiae

Resum

Durante los cuatro años de beca FICYT he trabajado sobre la proteína Rgt1, un factor transcripcional que reprime la expresión de determinados genes en ausencia de glucosa, y que participa en la expresión de otros en presencia de la misma. Mediante ensayos Northern, RT-PCR y análisis de la expresión beta-galactosidasa hemos demostrado que RGT1 se expresa de forma constitutiva. Además gracias a experimentos de localización utilizando fusiones con GFP hemos verificado que se localiza constitutivamente en el núcleo. Analizando la expresión del promotor HXK2 fusionado en pauta de lectura al gen indicador de beta-galactosidasa en mutantes rgt1 (obtenidos mediante interrupción genómica) y distintas fuentes de carbono hemos demostrado que Rgt1 regula la expresión del gen HXK2 en S.cerevisiae, inhibiéndola en medios con fuentes de carbono no fermentables. Sin embargo un mutante rgt1 no tiene alterada la expresión del gen SUC2 (inhibida por un complejo proteico del cual Hxk2 y Mig1 forman parte), que codifica para la invertasa. Estos datos son coherentes con otros resultados obtenidos que demuestran que Mig y Hxk2 no tienen alterado su patrón de localización celular en mutantes rgt1. Para saber cómo actúa Rgt1 sobre el promotor HKK2, se realizaron ensayos de retardo de la movilidad electroforética utilizando como sondas las secuencias reguladoras del promotor del gen HXK2 marcadas radiactivamente. Existen diferentes complejos ADN-proteina dependiendo de la fuente de carbono. Para demostrar que Rgt1 se une directamente al promotor HXK2 se repitieron estos ensayos con una proteína Rgt1 recombinante purificada, y se realizaron ensayos de inmunoprecipitación de la cromatina (CglP). Se han realizado ensayos de doble híbrido, coinmunopreciptación y coprecipitación GST -pull-down para demostrar la interacción in vivo e in vitro entre Rgt1 y las proteínas Hxk2 y Med8 en distintas condiciones de crecimiento. Además hemos acotado la región concreta de Hxk