Variación natural de botrytis cinerea. Análisis genético y genómico de las diferencias de agresividad

Resumen

Resumen La podredumbre gris es descrita en los viñedos de Castilla y Leon año tras año. Dependiendo en las condiciones climáticas, esta puede causar pérdidas sustanciales en el rendimiento del cultivo y alteraciones importantes en la calidad de los vinos producidos. Sin embargo, las poblaciones naturales del patógeno responsable no han sido caracterizadas en profundidad. En España, la actividad económica en relación con el cultivo de la vid y la producción de vino se organiza alrededor de la “Denominación de Origen” (D.O.) como figura administrativa. Los agricultores y productores de vino siguen pautas estrictas en relación con las variedades de vid que se pueden cultivar en cada caso, el manejo de los cultivos y los procedimientos de producción de vino, para obtener y mantener la certificación de vino de calidad con Denominación de Origen. En nuestro trabajo hemos evaluado la incidencia de la podredumbre gris en seis áreas productoras de vino en Castilla y León, cinco D.O. y una zona de Vinos de la Tierra, durante dos campañas distintas (2002, 2007). En el curso de estas evaluaciones se colectaron racimos sintomáticos y racimos que no presentaban síntomas de podredumbre gris a partir de los cuales se aislaron y purificaron aislados que respondían a las características propias de las especies del género Botrytis. En total fueron purificados 620 aislados de los cuales 283 fueron seleccionados para su análisis fisiológico y genético. Esta caracterización constituye la base fundamental del trabajo realizado en esta Tesis Doctoral. Haciendo uso de una combinación de métodos basados en análisis de ADN se ha demostrado que los aislados de B. cinerea predominan en las poblaciones recogidas. No obstante, fue posible identificar aislados pertenecientes a la especie B. pseudocinerea y a la especie B. prunorum, siendo esta la primera vez que se describe la presencia de aislados de estas especies en España. Asimismo, fueron caracterizados dos aislados que forman parte de una entidad genética relacionada con B. californica. En una primera aproximación ha sido posible determinar que la mayor parte de los aislados de B. cinerea analizados son aislados del genotipo Grupo N, aunque con baja frecuencia se han identificado aislados de genotipo Grupo S, siendo esta la primera ocasión en la que se cita la presencia de este genotipo en España. Dada la agresividad sobre vid de los aislados de B. prunorum y los aislados relacionados con B. californica, muy reducida en ambos casos, y la baja frecuencia con la que B.pseudocinerea parece estar presente, el impacto que estas especies puedan tener en el desarrollo de la podredumbre gris en los viñedos de Castilla y León debe ser muy limitado. Los aislados de B. cinerea muestran una diversidad fisiológica muy importante. En el contexto de este trabajo es interesante destacar que los aislados de B. cinerea muestran grandes diferencias en su habilidad para infectar hojas de V. vinifera, y que la distribución de los valores de agresividad en la población es una distribución de tipo normal sugestiva de la naturaleza cuantitativa de este carácter. Y es interesante destacar también que se han identificado varios aislados que representan variantes naturales incapaces de infectar la planta huésped, la mayoría de ellos del morfotipo micelial. El análisis de genética de poblaciones ha demostrado que la diversidad genotípica dentro de las poblaciones naturales de B. cinerea sobre los viñedos de Castilla y León es muy alta y que las infecciones múltiples de un mismo racimo con individuos genéticamente diferentes son muy frecuentes. El elevado nivel de diversidad genotípica observado, junto con la distribución equilibrada de ambos tipos sexuales y la detección de desequilibrio de ligamiento, permiten proponer que tanto la reproducción sexual como la reproducción asexual tienen lugar en el campo. El análisis de los coeficientes de diferenciación y el análisis de la varianza molecular indican que el factor D.O. donde se realizó el aislamiento impone un pequeño efecto de diferenciación entre poblaciones, un efecto que no puede explicarse sólo como consecuencia de las distancias geográficas entre las D.O., y por lo tanto de las poblaciones de aislados, sino más bien derivado de las prácticas de manejo del cultivo que imponen las D.O., que probablemente limitan la libre dispersión del patógeno. Nuestro estudio ha proporcionado variantes naturales de B. cinerea que consideramos que pueden resultar muy útiles en el análisis y disección de la capacidad de infectar de este patógeno. Disponiendo de aislados muy agresivos y de aislados incapaces de infectar que presentan tipos sexuales compatibles, ha sido posible proponer un análisis genético de la patogenicidad basado en la realización de cruzamientos. El cruzamiento entre el aislado B448, un aislado agresivo, que esporula profusamente y que produce esclerocios, con el aislado B371, un aislado no agresivo, que no esporula y que no produce esclerocios, ha generado una descendencia integrada por 183 individuos cuyo análisis ha proporcionado información muy interesante. En primer lugar, ha sido posible comprobar que cada una de estas tres características está controlada por un único gen, pues en los tres casos la segregación en la descendencia de las dos alternativas fenotípicas correspondientes es una segregación 1:1. En 3 segundo lugar, que se trata del mismo gen para los tres caracteres, dada la estricta cosegregación de las alternativas fenotípicas “capacidad de infectar”-“capacidad de esporular”- “capacidad de producir esclerocios” e “incapacidad de infectar”-“incapacidad de esporular”- “incapacidad de producir esclerocios”. Y, en tercer lugar, que este es probablemente un gen con efecto mayor sobre patogenicidad (y sobre capacidad de esporular y de producir esclerocios) que permite la expresión de varios factores de patogenicidad que segregan en la descendencia, ya que la descendencia agresiva del cruzamiento, que constituye el 50% de los individuos, lo es en medida variable. Esta observación es compatible con la naturaleza compleja, multigénica, de tipo cuantitativo, del carácter agresividad en B. cinerea y permite proponer que los aislados B448 y B371 son polimórficos al menos en varios de los QTLs implicados en la determinación del mismo. Nuestro grupo de investigación se ha propuesto, en una primera fase, abordar el aislamiento y caracterización del gen con efecto mayor sobre patogenicidad y, en una segunda, plantear la identificación de algunos de los QTLs responsables de la segregación observada para el carácter agresividad en la descendencia agresiva de este cruzamiento. La primera parte de esta propuesta ha sido abordada como parte de este trabajo de tesis doctoral. Para la identificación del gen con efecto mayor, se ha diseñado una estrategia experimental basada en la clonación posicional y en el análisis de segregantes agrupados. Su implementación ha supuesto la determinación a escala genómica de los polimorfismos de tipo SNP e INDEL entre los aislados B448 y B371 y el estudio de su segregación en dos grupos de descendientes, uno integrado por individuos agresivos, como el aislado B448, y otro por individuos no agresivos, como el aislado B371. La determinación de polimorfismos se ha llevado a cabo mediante secuenciación masiva de ambos genomas parentales con las tecnologías Illumina y Pac Bio. La combinación de la información proporcionada sobre los dos genomas con ambas metodologías permite disponer de dos buenos ensamblajes y de listados de polimorfismos extensos y fiables. Se han secuenciado posteriormente las dos mezclas de ADN de los dos grupos de descendientes establecidos en función de los fenotipos de los parentales. El análisis de las frecuencias alélicas de las variantes características de un parental y otro en ambas mezclas de ADN ha permitido identificar una región en el cromosoma 4 entre las coordenadas 1.240.000 y 1.320.000 para la que se detectan valores máximos de frecuencia de los alelos característicos del parental B448 en la mezcla de ADN de los descendientes agresivos y valores máximos de los alelos característicos del parental B371 en la mezcla de ADN de los descendientes no agresivos. Esta 4 es la distribución esperada para marcadores asociados a un gen responsable de esta diferencia fenotípica en este cruzamiento. La región identificada es una región amplia que incluye entre 40 y 50 genes. Para delimitar la posición del gen de interés, esta región del genoma del aislado B448 ha sido subclonada en fragmentos de 5 kb y los clones resultantes introducidos por transformación en el fondo genético del aislado B371. Sólo el inserto clonado en el plásmido pWAM15 ha determinado que los transformantes derivados muestren capacidad de esporulación, de producción de esclerocios y de infectar. Esta observación proporciona evidencias funcionales de que el polimorfismo responsable de la diferencia fenotípica entre ambos aislados se encuentra en esta región. El análisis de la anotación del genoma de B. cinerea y el estudio de los polimorfismos entre los genomas de los aislados B448 y B371 identificados en nuestro análisis permite identificar un único gen en la región seleccionada, el gen Bcin04g03490, y un único polimorfismo característico del aislado B371, como responsable del fenotipo observado. Este gen no ha sido caracterizado en B. cinerea. Se identifican ortólogos del mismo en los genomas de hongos, pero en ningún caso se aporta información funcional. El gen de B. cinerea codifica una proteína en la que es posible identificar dos dominios funcionales conservados: un dominio LbM_MAT_GAT en el extremo carboxilo de la proteína y un dominio GAL4 de unión a ADN en la zona central. Es interesante destacar que la proteína Bcin04g03490 presenta únicamente el dominio de unión a ADN de GAL4. No se identifica un dominio activador tipo. La mutación específica del aislado B371 en la posición 1.251.759 supone un cambio de aminoácido, concretamente el cambio Glicina por Arginina, que afecta a un aminoácido localizado en la región correspondiente al dominio LbM_MAT_GAT. Teniendo en cuenta los resultados obtenidos, es posible concluir que la proteína Bin04g03490P es esencial en la coordinación de los procesos relacionados con la capacidad de infectar del patógeno y también con la capacidad de esporular y de producir esclerocios. El alelo del gen Bcin04g03490 del aislado B371 es un alelo de pérdida de función derivado de una mutación puntual que determina la sustitución del aminoácido glicina por el aminoácido arginina en la posición 722 de la proteína Bcin04g03490P2. Este aminoácido forma parte del dominio conservado funcional LbM_MAT_GAT localizado en el extremo carboxilo de la proteína y resulta ser esencial para su actividad.