Estudio y caracterización de nuevos factores de virulencia del hongo fitopatógeno Botrytis cinerea mediante técnicas moleculares

Résumé

Botrytis cinerea es un hongo filamentoso capaz de infectar a más de 200 especies de plantas diferentes (Tudzynski and Kokkelink 2009), causando la enfermedad conocida como “Podredumbre Gris” o “Botrytis”. Este hongo presenta una gran versatilidad y una gran resistencia a condiciones ambientales adversas, siendo capaz de desarrollarse en regiones de clima templado como es el caso de España (Carbú et al. 2004), en áreas secas y desérticas de Israel (Yunis and Elad 1989) y en zonas frías como Alaska (Anderson 1924), causando cuantiosas pérdidas en la agricultura. Como consecuencia de la gran cantidad de cultivos que pueden verse afectados por el patógeno B. cinerea y a las repercusiones económicas que tiene sobre cultivos tan importantes como son la vid, la fresa, el tomate, plantas ornamentales…son numerosos los grupos de investigación que están realizando un gran esfuerzo por profundizar en el conocimiento de la biología del hongo B. cinerea así como en los posibles métodos de control del patógeno. Actualmente la mayor parte de las posibles estrategias de control que se pueden aplicar para combatir a este hongo filamentoso se basan en la aplicación de productos químicos aunque cada vez existen más restricciones para su empleo debido sobre todo a que son productos contaminantes del medio ambiente así como por la aparición de cepas resistentes a los mismos. Teniendo todo esto en cuenta resulta fundamental el conocimiento de los diferentes mecanismos de patogenicidad del hongo para poder diseñar estrategias de control que den buenos resultados. Para ello sería interesante establecer como objetivo la identificación de diferentes genes que pudieran estar involucrados con los mecanismos de patogenicidad, virulencia o supervivencia del hongo B. cinerea para lo cual pueden llevarse a cabo diferentes aproximaciones experimentales. A lo largo de los años muchas técnicas moleculares se han empleado con el objetivo de conocer los genes implicados en la patogenicidad y/o virulencia del hongo fitopatógeno B. cinerea. Gracias a la gran cantidad de técnicas moleculares disponibles hoy día, tales como métodos de transformación, vectores, genotecas,etc., ha sido posible la identificación y caracterización de un gran número de genes implicados directa o indirectamente en la patogenicidad. Todas estas técnicas junto con la reciente secuenciación del genoma de B. cinerea hacen que cada día esté más cerca el conocimiento completo de los genes implicados en la patogenicidad y/o virulencia de este hongo con todo lo que ello implica. Cada fase del proceso de infección requiere diferentes estadios de desarrollo e implica la participación de diferentes “factores” de patogenicidad y/o virulencia. Los genes que causan patogenicidad se definen como aquellos genes necesarios para el desarrollo de la enfermedad, pero que no son esenciales para el patógenos para completar su ciclo de vida in vitro (Van De Wouw et al. 2011). Por otro lado los “factores de virulencia” se asocian a las características intrínsecas y a cualquier componente que sea esencial para el microorganismo para causar la enfermedad y desarrollar su capacidad de hacerlo. En el capítulo 1 de esta tesis para la identificación de posibles genes implicados con la patogenicidad, virulencia y/o supervivencia del hongo se llevaron a cabo mutantes knock-out de genes de interés y se llevaron a una primera caracterización de los mismos llevando cabo los bioensayos de patogenicidad en phaseolus vulgaris. De este modo pudimos caracterizar la capacidad de infectar o colonizar la planta huésped de cada uno de los mutantes utilizando como referencia los bioensayos realizados con la cepa WT. Para determinar si alguno de los genes objeto de estudio es esencial en el proceso de patogénesis es necesario disponer de mutantes deficientes específicamente en cada uno los genes de estudio, y de un sistema experimental que permita comparar su capacidad para infectar a la planta huésped con la de la cepa silvestre. En base a los resultados obtenidos en el capítulo 1, y teniendo en cuenta que de todos los mutantes generados solo uno de ellos fue el que mostro claras diferencias comparándolo con la WT se planteó realizar un capitulo 2 en el que se analizaron y caracterizaron en profundidad los tres mutantes independientes obtenidos del gen Bccpa1 (BC1G_06387) de B. cinerea. En el capítulo 3 se planteó realizar un estudio mediante la aplicación del método OSMAC (one strain-many compounds), el cual se basa en someter al microorganismo de estudio a diferentes condiciones de crecimiento en fermentación, para ello se producen variaciones de distintos parámetros como son por ejemplo el tipo de recipiente de crecimiento, la aireación, la composición del medio, y/o la adicción de inhibidores enzimáticos (Brakhage et al. 2011;Scherlach et al. 2009; Zerikly et al. 2009; Chiang et al. 2009) para inducir la biosíntesis de nuevos metabolitos no identificados en las condiciones estándar de crecimiento del microrganismo.Teniendo en cuenta los numerosos trabajos que anteriormente se habían llevado a cabo mediante el empleo de la metodología OSMAC se planteó llevarlo a cabo en B. cinerea. Los antecedentes de este trabajo se basan en un ensayo realizado por el grupo de orgánica de la Universidad de Cádiz dirigido por el catedrático Isidro Collado. Observaron que al crecer las cepas B05.10 y UCA 992 de B .cinerea sobre un medio CD al que se le adicionaron cantidades subletales (5-30 ppm) de CuSO4 mostraton una serie de modificaciones metabólicas. En la bibliografía esta descrito como la adición de cobre a los medios de cultivo induce cambios en el metabolismo secundario de Penicillium brasilianum (Fill et al. 20016). En el capítulo 4 se llevó a cabo el estudio de la cepa de B. cinerea que es superproductora de ABA (ATCCG3) en el medio liquido CD durante 23 días de fermentación, y se estudiaron mediante RT-PCR los niveles de expresión de los genes implicados en las rutas de biosíntesis de botridial así como de los tres genes conocidos que están directamente implicados en la biosíntesis del ácido botcinico en cada una de las muestras tomadas. Por otro lado también nos planteamos realizar el estudio de expresión sobre esta misma cepa de los genes que están dentro del clúster de síntesis del ABA. En el capitulo 5 se tuvo en cuenta los buenos resultados que previamente se habían obtenido en trabajos en los que se han identificado nuevos metabolitos y productos naturales mediante técnicas epigenéticas (Chen et al.2013; Asai et al. 2011; Wang et al. 2010; Williams et al. 2008) se planteó el empleo de modificadores epigenéticos con el objetivo de inducir la biosíntesis de nuevos metabolitos de origen policétido que hasta el momento no se había identificado su producción por parte del hongo fitopatógeno B. cinerea. El modificador epigenético que se empleo fue el ácido hidroxámico suberoilanilida (SAHA) el cual tiene la con la capacidad de actuar inhibiendo la histona desacetilasas (HDAC). En la bibliografía se han descrito numerosos trabajos en los que se emplean el SAHA como inhibidor de HDACs ( Lin Du et al. 2014; Gui et al. 2004).