Andamios y biomoléculas de origen marino para regeneración tisular del sistema osteoarticular

  1. Estefanía López Senra
Supervised by:
  1. Julia Serra Rodríguez Director
  2. Miriam López Álvarez Director

Defence university: Universidade de Vigo

Year of defence: 2019

Committee:
  1. María Helena Figueira Vaz Fernandes Chair
  2. Stefano Chiussi Secretary
  3. Patricia Díaz Rodríguez Committee member

Type: Thesis

Abstract

La evolución y cambio de paradigma en el que se encuentra actualmente la medicina ha promovido una intensa investigación enfocada hacia la regeneración de tejidos dañados y/o perdidos. La idea se centra en intentar reproducir la propia organización de los tejidos, la cual se basa en estructuras tridimensionales que permiten el desarrollo de una función biológica específica y aportan las condiciones apropiadas para la nutrición y la organización espacial de las células. Basados en esto y para lograr su cometido, la ingeniería de tejidos propone la combinación de tres elementos básicos: andamios, células y factores de crecimiento o moléculas bioactivas. En este contexto, se enmarca el objetivo principal de este trabajo de investigación centrado en el estudio de nuevas estructuras porosas y biomoléculas de interés que permitan replicar la matriz extracelular de los tejidos que componen el sistema osteoarticular (huesos, articulaciones y ligamentos) para promover su regeneración centrándonos, en particular, en el hueso y el cartílago. Para ello, se aborda en primer lugar la fabricación, caracterización y ensayo in vitro de andamios basados en la combinación de un polímero y una biocerámica, para seguidamente incorporar el estudio de una biomolécula, todos ellos de origen marino. El primer abordaje experimental para la obtención de andamios se realiza combinando colágeno (ASC) y fosfato de calcio (CaP; en granos de 20-63 µm), empleando reticulantes químicos que refuerzan la estructura del polímero. El colágeno y la biocerámica se obtienen de subproductos de la pesca, en concreto de piel y dientes del tiburón, respectivamente. Como segunda estrategia se sustituye el colágeno por alginato de sodio (Alg), obtenido de algas pardas, y se utiliza cloruro de calcio como agente reticulante. En cuanto a la biomolécula, se realiza el estudio fisicoquímico y biológico del condroitín sulfato (CS) extraído también de diferentes fuentes de subproductos pesqueros. Entrando en detalle en la fabricación de los andamios, para los ASC/CaP se elaboraron cuatro formulaciones empleando ratios de ASC:CaP correspondientes a 100:0, 70:30, 50:50 y 30:70. En cuanto al reticulante se estudiaron dos agentes: N-(3-Dimetilaminopropil)-N′-etilcarbodiimida) clorhidrato/N-hidroxisuccinimida (EDC/NHS) y el diisocianato de hexametileno (HMDI). Para el agente EDC/NHS se evaluaron dos porcentajes de reticulación del colágeno 12.5 y 25%, mientras para el HMDI esos porcentajes fueron 1% y 5%. En el caso de los andamios Alg/CaP se utilizó una proporción 70:30 entre polímero y biocerámica, estudiando seis formulaciones de Alg+CaP (peso)/agua (volumen)) correspondientes a 3,6 y 9% p/v. En este caso el agente reticulante utilizado fue CaCl2 y se evaluaron los andamios con porcentajes de reticulación de 1.6 y 12.5%. Se fabricaron andamios de referencia sólo con alginato para cada una de las formulaciones. La caracterización fisicoquímica de los diferentes andamios se realizó en base a cinco aspectos básicos: estabilidad en condiciones fisiológicas, bioactividad, distribución de la biocerámica en la red polimérica, porosidad y propiedades mecánicas. Para ello, dentro de las técnicas de análisis disponibles, se utilizó microscopía electrónica de barrido para identificar las propiedades bioactivas de los andamios, microtomografía computarizada para su caracterización estructural y distribución de la biocerámica en la red polimérica y ensayos mecánicos de fuerza compresiva para valorar las propiedades mecánicas. La respuesta biológica de los andamios se evaluó in vitro de acuerdo a la normativa ISO 10993. En particular, la citotoxicidad celular se analizó mediante ensayo por contacto directo de los diferentes andamios sobre la monocapa celular con líneas de osteoblastos a diferentes tiempos de incubación, cuantificando la actividad metabólica mitocondrial (MTS). La viabilidad y distribución de las células directamente sembradas en los andamios se testó mediante una tinción estándar que permite diferenciar células vivas de muertas y utilizando microscopía confocal para su observación. En cuanto a la biomolécula, condroitín sulfato, las muestras obtenidas a partir de cinco subproductos de la pesca: Prionace glauca (cabeza), Raja clavata (esqueleto), Scyliorhinus canicula (aleta), Chimaera monstrosa (cabeza, esqueleto y aleta) y Galeus melastomus (cabeza, esqueleto y aleta), se caracterizaron utilizando espectroscopía Raman para valorar la prevalencia en isómeros 4S o 6S en cada una de ellas. Su respuesta biológica se evaluó mediante ensayo in vitro analizando su citotoxicidad, para diferentes concentraciones, con dos líneas celulares; una de osteoblastos (MG-63) y otra de cartílago (T/C 28a2). Además, se realizó un estudio de condrogénesis con células madre mesenquimales de pacientes con patología osteoartrítica. En lo que respecta a las estructuras porosas, los resultados obtenidos demostraron la viabilidad para fabricar andamios de origen marino basados en una estructura polimérica en la cual se encuentra distribuida de forma homogénea el granulado biocerámico. Este comportamiento ocurre tanto en la combinación ASC/CaP como Alg/CaP, empleando diferentes porcentajes entre el polímero y la biocerámica y utilizando diversos agentes reticulantes. Entre las conclusiones más específicas cabe destacar la estabilidad de los andamios ASC/CaP reticulados al 5% con HMDI y al 12.5 y 25% con EDC/NHS siendo superior para la formulación ASC:CaP 30:70. Se descarta el andamio reticulado al 1% con HDMI. Así mismo, se demostró que la presencia de la biocerámica promueve la bioactividad, siendo más intensa cuanto mayor es la cantidad de CaP que se incorpora al andamio. Respecto a las propiedades estructurales y mecánicas, los parámetros óptimos correspondieron a la reticulación EDC/NHS 12.5 % y HMDI 5%, para las tres proporciones ASC:CaP estudiadas, descartándose EDC/NHS 25% por su reducido tamaño de poro e interconectividad. Finalmente, la caracterización biológica demostró la ausencia de citotoxicidad y una adecuada proliferación celular en el andamio EDC/NHS 12.5%, para las tres formulaciones testadas. En el caso de los andamios Alg/CaP, todas las formulaciones estudiadas presentaron estabilidad a 28 días de incubación en medio de cultivo. No obstante, es interesante destacar que para los andamios de referencia fabricados sólo con alginato de sodio en agua al 3% p/v la estabilidad desaparece, lo que indicaría que para esta concentración la presencia de CaP puede jugar un papel importante. El incremento en la relación p/v promovió un mayor grado de bioactividad, al conllevar un aumento en la cantidad de CaP (al igual que de alginato). En cuanto a las propiedades estructurales y mecánicas, de las formulaciones estudiadas destacan el andamio Alg/CaP 6% p/v (1.6%) y el 9% p/v (12.5%). Los ensayos biológicos confirmaron la ausencia de citotoxicidad tras 7 días y proliferación celular directa sobre los andamios tras 3 días de incubación en los andamios Alg/CaP 6% p/v y 9% p/v ambos reticulados al 12.5% con CaCl2. En lo que respecta a la biomolécula, condroitín sulfato, se demostró la ausencia de citotoxicidad y la promoción de la proliferación celular tanto en osteoblastos como en condrocitos para todas las fuentes marinas estudiadas a la concentración de 100 µg/ml. Mediante ensayo condrogénico se demostró la capacidad del CS obtenido de Raja clavata y de Scyliorhinus canicula para promover la diferenciación y mantener el fenotipo de condrocito articular, síntesis de glicosaminoglicanos y biomoléculas específicas de cartílago, así como ausencia en la expresión de marcadores de respuesta inflamatoria, de fibrocartílago o cartílago hipertrófico. En cuanto a la prevalencia de la sulfatación del CS (caracterizado por espectroscopia Raman para cada una de las fuentes estudiadas) y su influencia en los resultados biológicos, se determinó que un equilibrio entre los isómeros C4S y C6S en la composición de la biomolécula en cuestión es la que parece generar una mejor respuesta condrogénica. Se proporcionan por tanto las condiciones optimizadas de dos andamios de origen marino para regeneración de tejido óseo, así como la puesta a punto en cuanto a propiedades y resultados celulares de nuevas fuentes de la biomolécula condroitín sulfato, con un papel fundamental en la regeneración del cartílago. Todo ello abre nuevas vías para su reformulación incluyendo la regeneración de defectos osteoarticulares, por ejemplo, mediante la precipitación de la biocerámica hacia extremo del andamio en contacto con el hueso subcondral y/o la posterior inyección de la biomolécula una vez se haya integrado el andamio correspondiente. Se trata por tanto de la visión integradora de la ingeniería de tejidos englobando los tres componentes: andamios, células y biomoléculas. La elaboración de la presente Tesis Doctoral ha sido posible gracias a la financiación obtenida de la Xunta de Galicia: Programa de consolidación e estructuración de unidades de investigación competitivas (Grupos de referencia competitiva GRC2013-008) y BIOFAST-IN855A2016/06 Programa Ignicia-proba de concepto; y de la Unión Europea: Programa ATLANTIC AREA, MARMED-2011-1/164- Development of innovating biomedical products from marine resources valorisation y Programa POCTEP, 0302_CVMAR_I_1_P 2017-2019- Industrial innovation through specific collaborations between companies and research centres in the field of marine biotechnology valorisation, y proyecto europeo Instituto de Bioingeniería en Red para el envejecimiento Saludable (IBEROS)