Análisis genético y molecular de tubulopatías primarias y utilización de un ratón knock-in para investigar una estrategia terapéutica en la enfermedad de dent-1

Resumen

Las tubulopatías primarias pertenecen al grupo de enfermedades raras, con una prevalencia de menos de 5 casos por cada 10.000 habitantes. Los datos de la Federación Española de Enfermedades Raras (FEDER) apuntan que la cifra de españoles afectados por las enfermedades consideradas raras es de más de tres millones, de los cuales unos 170.000 residen en Canarias. La gravedad del fenotipo de las tubulopatías primarias es muy variable, desde una afectación mínima de la función renal a largo plazo, hasta la aparición de anomalías con afectación severa de la función renal en el feto que comprometen su viabilidad. Suelen debutar en edad pediátrica, y con frecuencia, el diagnóstico y tratamiento de estas enfermedades es complejo, ya que su baja prevalencia se traduce en una falta de experiencia por parte del personal médico y en el retraso del diagnóstico. En este trabajo nos centraremos en la enfermedad de Dent, la HFHN, el síndrome de Lowe y otras hipomagnesemias. Para ninguna de estas enfermedades se dispone de terapias efectivas dirigidas a corregir el defecto molecular causado por la deficiencia de las proteínas defectuosas, no existe tratamiento específico ni se han desarrollado ensayos clínicos que puedan derivar en una opción terapéutica. Los únicos tratamientos son sintomáticos, dirigidos a retrasar la progresión de la enfermedad y el deterioro de la función renal, así como a mejorar la calidad de vida de los pacientes. La mayoría de las mutaciones causantes de estas enfermedades son únicas, por lo que resulta difícil establecer una correlación genotipo-fenotipo. Por ello, la comprensión del efecto real de las mutaciones es vital para el desarrollo de opciones terapéuticas. Nuestro grupo ha identificado las mutaciones que causan distintas tubulopatías en pacientes españoles, algunos de ellos canarios, y de otros países. En la actualidad, centramos nuestro interés en comprender el efecto de las mutaciones mayoritariamente exónicas causantes de enfermedad tanto a nivel de la proteína resultante, como a nivel del procesamiento del pre-ARN mensajero (ARNm) o proceso de splicing, ya que se estima que un 25% de estas variantes podrían alterar este mecanismo. En el caso de la HFHN, nuestro interés se centra en caracterizar el efecto de las mutaciones descritas a nivel de procesamiento del pre-ARNm, ya que en los últimos años se han comenzado a desarrollar estrategias terapéuticas basadas en la comprensión de sus mecanismos reguladores, y permiten corregir o paliar los efectos de este tipo de mutaciones. En el caso de la enfermedad de Dent, y con el fin de comprender los efectos de las diferentes mutaciones descritas, se ha realizado una clasificación de las mismas en 4 tipos; (A) las que hacen que la proteína mutante (ClC-5) se pliegue de manera alterada y quede retenida en el retículo endoplásmico (RE), (B) mutaciones que no afectan a la localización subcelular de ClC-5, pero reducen o eliminan por completo la actividad del intercambiador, (C) las que implican un defecto en la acidificación de los endosomas y (D) mutaciones que dan lugar a ARN mensajeros defectuosos que se degradan con rapidez y hacen que la proteína no se exprese. Nuestro interés se centra en la primera categoría, ya que en la actualidad hay fármacos que corrigen de manera parcial el defecto y hacen que la proteína mutante pueda llegar parcialmente a su localización habitual en la membrana, como se ha visto en estudios con otros genes. Las chaperonas químicas son moléculas pequeñas capaces de penetrar en las células que se unen y estabilizan a una proteína diana. En muchas enfermedades causadas por mal plegamiento de proteínas, la chaperona química estabiliza la proteína diana en el RE y le permite salir del mismo y ser transportada a través del Golgi hasta su destino final. Diversos estudios han demostrado que el uso de chaperonas químicas de bajo peso molecular, puede aliviar los síntomas de patologías renales, neurológicas y respiratorias. Una de estas chaperonas es el 4-fenilbutirato (4-PBA). Este fármaco está autorizado y comercializado en España y Europa y se utiliza en el tratamiento de enfermedades metabólicas hereditarias. Su potencial terapéutico se ha podido establecer en modelos de diferentes enfermedades in vivo e in vitro, donde se ha comprobado que atenúa el estrés del RE y disminuye la apoptosis en células del túbulo renal y la fibrosis intersticial renal. En las dos últimas décadas, nuestra compresión de los mecanismos que causan la enfermedad de Dent ha aumentado significativamente gracias a diversos los modelos experimentales de ratones knock-out (KO) para ClC-5. Hasta la fecha no se han generado ratones knock-in (KI) con mutaciones puntuales o pequeñas inserciones o deleciones de CLCN5 identificadas en pacientes con la enfermedad de Dent, ni tampoco se han desarrollado enfoques terapéuticos. A diferencia de los ratones KO, donde la expresión del gen es nula, los ratones KI en general expresan una proteína mutada. Estos modelos se utilizan como estrategia complementaria o alternativa al ratón KO y tienen varias aplicaciones incluyendo el estudio del papel fisiológico de la mutación específica que causa la enfermedad en humanos.