Estudio genético y bioquímico de la ruta de degradación del colesterol en "Rhodococcus" spp

  1. Laura Fernández de las Heras
Supervised by:
  1. J.M. Navarro Llorens Director

Defence university: Universidad Complutense de Madrid

Year of defence: 2012

Committee:
  1. Antonio Tormo Garrido Chair
  2. David Bartolomé Martín Secretary
  3. Esteban Martínez García Committee member
  4. Jose Luis Garcia Lopez Committee member
  5. María Teresa Del Peso Santos Committee member

Type: Thesis

Abstract

Los estudios realizados para este trabajo se han llevado en cabo en cepas bacterianas capaces de crecer en colesterol y otros esteroides como única fuente de carbono y energía: Rhodococcus sp. CECT3014 y R. ruber strain Chol-4. Esta última ha sido ob tenida y caracterizada genética y bioquímicamente a lo largo de este trabajo a partir de una muestra de lodo de una planta de tratamiento de aguas residuales. Los resultados presentados se centran en dos actividades presentes en estas cepas que parti cipan en diferentes etapas de la ruta de degradación del colesterol: las enzimas colesterol oxidasas (ChoOxs) que actúan al inicio de la ruta y las enzimas 3-cetosteroide-?1-deshidrogenasas (KstDs) que pertenecen a una etapa intermedia. Los genes ch oG de R. ruber y choG de CECT3014 codifican colesterol oxidasas funcionales y, por tanto, estarían involucradas en la conversión del colesterol en colestenona. ChoG es la principal actividad colesterol oxidasa en CECT3014, siendo esta actividad induc ible al menos en presencia de colesterol y colestenona. La mutagénesis de choG en CET3014 no impide el crecimiento de esta estirpe en colesterol, aunque conlleva a una pérdida de la actividad ChoOx. Sin embargo, ChoE de CECT3014 presenta una gran ide ntidad con otras ChoOxs pero no parece actuar como tal y su función sigue siendo desconocida. Se han clonado y caracterizado bioquímicamente 3 KstDs de R. ruber. KstD1 y KstD2 muestran preferencia por 3-cetoesteroides con un doble enlace C4-C5, mien tras que KstD3 sólo utiliza esteroides con el anillo A saturado. La funcionalidad de los 3 genes kstDs se ha analizado mediante la construcción de mutantes simples, dobles y triple. Todos aquellos mutantes con kstD2 delecionado son incapaces de crece r en AD como única fuente de carbono y energía, mientras que ambos genes kstD2 y kstD3 deben ser mutados para impedir el crecimiento en colesterol. kstD1 no es esencial para el crecimiento en AD o en colesterol. Por HPLC se detecta la acumulación de 9OHAD en los mutantes para kstD2 de R. ruber strain Chol-4, por lo que no hay otra actividad KstD que tome su relevo. Tomando en consideración los datos de actividad y de RT-PCR, así como los datos de crecimiento y HPLC de los mutantes en kstDs, pod emos concluir que para R. ruber strain Chol-4: i) KstD1 y KstD2 serían responsables de la conversión del AD en ADD; ii) el aumento en la expresión de kstD1 en presencia de AD dependería de la presencia de kstD2, ya que en los mutantes en kstD2 no se