Caracterización farmacológica y miolecular del receptor nicotínico para la acelticolina de la célula cromafín bovina

  1. Elena Escalona Quirós
Supervised by:
  1. Luis Gandía Juan Director

Defence university: Universidad Autónoma de Madrid

Year of defence: 2009

Committee:
  1. Antonio Garcia Garcia Chair
  2. Jorge Fuentealba Arcos Secretary
  3. Victoria Maneu Flores Committee member
  4. Matilde Yáñez Jato Committee member
  5. Mercedes Villarroya Sánchez Committee member
  6. José David Machado Ponce Committee member
  7. Francisco Luis Sala Merchán Committee member

Type: Thesis

Abstract

ÍNDICE INTRODUCCIÓN...................................................................................................................1 1. MARCO EN EL QUE SE DESARROLLA ESTA TESIS ..................................................2 2. LA CÉLULA CROMAFÍN COMO MODELO NEUROSECRETOR ..................................3 2.1. La glándula adrenal..................................................................................................3 2.2. La célula cromafín y otras células de la médula adrenal ..........................................6 2.3. La célula cromafín como modelo de neurona secretora: el término paraneurona.............................................................................................................7 2.4. Funciones fisiológicas de la célula cromafín.............................................................8 3. CANALES IÓNICOS IMPLICADOS EN LA EXCITABILIDAD DE LA CÉLULA CROMAFÍN ....................................................................................................................9 3.1. Canales iónicos activados por voltaje..................................................................... 10 3.2. Canales iónicos activados por ligando ................................................................... 11 3.3. Otros canales......................................................................................................... 13 4. EL PROCESO SECRETOR DE CATECOLAMINAS .................................................... 14 4.1. Acoplamiento excitación-secreción: papel mediador del calcio .............................. 14 4.2. Homeostasis celular del calcio ............................................................................... 16 4.3. La vesícula cromafín .............................................................................................. 17 4.4. El proceso exocitótico ............................................................................................ 17 4.5. El proceso endocitótico .......................................................................................... 18 5. EL RECEPTOR NICOTÍNICO DE TIPO NEURONAL ................................................... 19 5.1. Estructura y composición de los nAChRs neuronales ............................................ 19 5.2. Clasificación de los nAChRs neuronales................................................................ 22 5.3. Aspectos funcionales de los nAChRs neuronales .................................................. 23 5.4. Modulación del nAChR neuronal............................................................................ 25 3 5.5. Farmacología de los nAChRs neuronales .............................................................. 27 5.6. Importancia fisiopatológica de los nAChRs neuronales .......................................... 29 5.7. nAChRs en la célula cromafín bovina..................................................................... 31 JUSTIFICACIÓN Y OBJETIVOS ........................................................................................ 33 MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................... 35 1. AISLAMIENTO Y CULTIVO DE CÉLULAS CROMAFINES BOVINAS.......................... 36 2. CULTIVO DE CÉLULAS PC12 ..................................................................................... 37 3. REGISTRO DE CORRIENTES IÓNICAS MEDIANTE LA TÉCNICA DE PATCHCLAMP ......................................................................................................................... 38 3.1. La técnica de patch-clamp ..................................................................................... 38 3.2. Registro de corrientes nicotínicas en células cromafines bovinas .......................... 40 4. REGISTRO DE CORRIENTES NICOTÍNICAS EN OVOCITOS DE XENOPUS LAEVIS......................................................................................................................... 42 5. MEDIDA DE LA CONCENTRACIÓN DE Ca2+ CITOSÓLICO EN POBLACIONES CELULARES ................................................................................................................ 44 6. MEDIDA DE LA SECRECIÓN DE CATECOLAMINAS EN POBLACIONES CELULARES ................................................................................................................ 45 7. PURIFICACIÓN E INMUNODETECCIÓN DE RECEPTORES QUE CONTIENEN LA SUBUNIDAD 7 ...................................................................................................... 47 7.1. Purificación de nAChRs que contienen la subunidad 7 mediante inmunoprecipitación ............................................................................................... 47 7.2. Inmunodetección de las subunidades nicotínicas 3 y 7 mediante la técnica de Western blot ...................................................................................................... 49 8. SOLUCIONES Y COMPUESTOS QUÍMICOS UTILIZADOS ........................................ 51 9. ANÁLISIS ESTADÍSTICO............................................................................................. 51 4 RESULTADOS.................................................................................................................... 53 1. EFECTO DE BLOQUEADORES SELECTIVOS 7 SOBRE LAS CORRIENTES INDUCIDAS POR ACh EN RECEPTORES NICOTÍNICOS BOVINOS ......................... 54 2. EFECTO DEL AGONISTA SELECTIVO 7 PNU-282987 SOBRE RECEPTORES NICOTÍNICOS BOVINOS ............................................................................................. 57 3. EFECTO DE LA PERFUSIÓN CONTINUA DEL AGONISTA SELECTIVO 7 PNU- 282987 SOBRE LAS CORRIENTES INDUCIDAS POR ACh EN RECEPTORES NICOTÍNICOS BOVINOS ............................................................................................. 60 4. EFECTO DEL MODULADOR ALOSTÉRICO SELECTIVO 7 PNU-120596 SOBRE RECEPTORES NICOTÍNICOS BOVINOS....................................................... 62 5. EFECTO DE DIVERSOS LIGANDOS SELECTIVOS 7 SOBRE LA CONCENTRACIÓN DE Ca2+ CITOSÓLICO EN POBLACIONES CELULARES............ 65 6. EFECTO DE DIVERSOS LIGANDOS SELECTIVOS 7 SOBRE LA SECRECIÓN DE CATECOLAMINAS EN POBLACIONES DE CCB................................................... 72 7. PURIFICACIÓN E INMUNODETECCIÓN DE RECEPTORES QUE CONTIENEN LA SUBUNIDAD 7 ...................................................................................................... 75