Supercritical technology applied to the development of drug delivery systems for bone regeneration

Resumen

La medicina regenerativa está experimentando un creciente auge con un enorme desarrollo en los últimos años. Esta tendencia se halla ligada a la creciente demanda de soluciones sociosanitarias para problemas derivados de los procesos naturales derivadas del envejecimiento y de las necesidades de reparación de lesiones asociadas no sólo a accidentes laborales y de tráfico sino también a nuevos hábitos de vida, como la práctica generalizada de deporte. Las aproximaciones clásicas para hacer frente al deterioro o la pérdida de un tejido se basan, principalmente, en incorporar un material con capacidad para suplir la pérdida física pero sin recuperar la función completa de ese tejido. Un buen ejemplo de ello son las prótesis metálicas que se implantan en sustitución de huesos o porciones de hueso en el caso de fracturas grandes o resecciones quirúrgicas asociadas a tumores. El principal problema de las prótesis inertes es que, aunque sirven de puente entre los extremos de la lesión, también actúan como obstáculo frente a la regeneración natural del tejido. En el caso de una persona en crecimiento, esto obliga incluso a intervenciones periódicas para sustituir la prótesis por otra de dimensiones mayores. Por otra parte, en el caso de un paciente adulto, la durabilidad de la prótesis puede resultar insuficiente dada la creciente esperanza de vida de la población. El estudio del proceso de regeneración natural de los tejidos en los seres vivos encierra un gran interés para solventar estas limitaciones ligadas a las prótesis inertes, puesto que se pretende aprovechar el conocimiento sobre las cascadas de curación y reparación para plantear aproximaciones biomiméticas. La gran mayoría de los tejidos de nuestro organismo se encuentran en un proceso continuo de regeneración para suplir el desgaste natural que permite que las pequeñas lesiones se reparen espontáneamente. Cuando la lesión supera un cierto tamaño (variable según el tejido) denominado crítico, los mecanismos de regeneración fallan y el organismo desencadena procesos de cicatrización para mantener la homeostasis, dando lugar a tejidos de prestaciones inferiores a las del tejido no lesionado. Si la herida es muy grande, puede ocurrir que no se produzca la cicatrización, convirtiéndose en una lesión crónica. La regeneración natural de los tejidos se basa, a grandes rasgos, en la formación de un nicho o soporte adecuado en el que se puedan asentar, diferenciarse y proliferar las células. Para imitar este proceso resulta necesario, por lo tanto, contar con materiales que puedan servir de andamios (scaffolds, en la terminología inglesa) que alberguen las células adecuadas o las sustancias activas necesarias para atraerlas y regular su crecimiento. La utilización de porciones sanas del mismo tejido como scaffold en una zona lesionada ha sido ampliamente investigada. El injerto de hueso del propio paciente (autólogo) reúne las tres características deseables para la regeneración de lesiones de tamaño superior al crítico: osteoconducción, es decir, sirve de guía (andamio) en el proceso de reparación del hueso natural; osteoinducción, contiene las sustancias necesarias para fomentar que las células no diferenciadas se conviertan en osteoblastos activos; y osteogénesis, aporta células de hueso que deben contribuir a la remodelación ósea. A pesar de los buenos resultados clínicos que se obtienen, el injerto autólogo tiene los inconvenientes de requerir una intervención adicional para extraer tejido de la zona dadora, que en pacientes mayores o con alguna patología crónica puede ser un área muy limitada y de curación lenta, e implica el riesgo de infecciones. Las alternativas naturales con injertos procedentes de donantes (aloinjertos) o de animales (xenoinjertos) presentan riesgo de rechazo, de transmisión de enfermedades y su capacidad osteogénica se ve limitada, ya que el tejido se debe descelularizar previamente a la implantación para reducir el riesgo de reacciones inmunes frente al injerto. El tejido óseo es, después de la sangre, el tejido con mayor demanda de trasplante, lo que ha motivado un mayor esfuerzo investigador en el diseño de scaffolds sintéticos específicos para hueso. Los scaffolds sintéticos deben tener una estructura tridimensional porosa que guie y promueva el crecimiento de los tejidos, que facilite la difusión de nutrientes y oxígeno y la eliminación de productos de desecho de las células, y que cuente con propiedades mecánicas similares al tejido a reemplazar. La porosidad debe estar entre el 65 y el 80 %, combinando microporos (~ 10 µm) que faciliten la adhesión celular y macroporos (~ 350 µm) que permitan la colonización celular no sólo en superficie sino también en profundidad. Además de ser biocompatible ‒es decir, que ni los materiales ni los productos de degradación pueden resultar tóxicos para las células‒ el scaffold debe biodegradarse a la misma velocidad a la que se forma el nuevo tejido, de manera que proporcione soporte mecánico sin impedir la regeneración completa del tejido. El scaffold sintético no debe desempeñar un papel meramente pasivo en la regeneración, sino que debe modular la respuesta del organismo al daño y también el comportamiento de las células que lo colonicen. En este sentido se ha ensayado la incorporación de una amplia variedad de sustancias activas, principalmente factores de crecimiento con capacidad osteoinductiva. Desde un punto de vista tecnológico, los dos principales retos que plantea la preparación de scaffolds rígidos porosos son: a) conseguir que su arquitectura porosa interna se ajuste a las características de la estructura del hueso, con una población bimodal de poros interconectados; y b) evitar la eliminación y la pérdida de actividad de los factores de crecimiento o fármacos necesarios para promover la adhesión, diferenciación y proliferación celular. Los procedimientos clásicos de preparación de materiales porosos implican, en su mayoría, la exposición de polímeros y porógenos a disolventes orgánicos volátiles, la aplicación de calor hasta alcanzar temperaturas relativamente elevadas para fundir el polímero y/o evaporar el porógeno o la lixiviación con disolventes que arrastren el porógeno. Ninguna de estas técnicas permite un control preciso de la estructura porosa. Además, tienen el riesgo de que las sustancias activas se pierdan por degradación o por lavado, lo que redunda en un bajo rendimiento de carga. En los últimos años, la tecnología de fluidos supercríticos y comprimidos se está revelando como una herramienta capaz de dar respuesta a los principales retos de la medicina regenerativa. Si bien esta tecnología se viene utilizando desde hace tiempo en campos muy variados, tan sólo recientemente ha empezado a ensayarse con biomateriales. Los fluidos alcanzan condiciones supercríticas cuando la temperatura y la presión se sitúan por encima de las del punto crítico, caracterizados por su temperatura (Tc) y presión crítica (Pc), respectivamente. Los fluidos supercríticos están dotados de propiedades fisicoquímicas singulares que los hacen muy útiles para el procesado de materiales, destacando su elevada difusividad, que permite que penetren en materiales con morfologías y texturas complejas. El CO2 supercrítico (scCO2) es el fluido supercrítico más empleado debido a que las condiciones moderadas de su punto crítico (73,8 bar, 31,1 ºC) son adecuadas para materiales lábiles. Además, no es inflamable, es económico, relativamente inerte y está considerado como seguro (GRAS). El interés en el scCO2 para la preparación de scaffolds porosos se basa en su capacidad para disolverse en polímeros amorfos y semicristalinos. El scCO2 actúa como plastificante, reduciendo el punto de fusión y la temperatura de transición vítrea de los polímeros. Los poros se forman en el material durante la despresurización cuando la remoción del CO2 da lugar a una inestabilidad termodinámica que provoca la expansión de la matriz polimérica. La porosidad del producto resultante depende de la cantidad de CO2 que se adsorbe durante el espumado, y se puede ajustar regulando la temperatura, la presión y el tiempo de procesado. La interconectividad de los poros depende de la velocidad de despresurización y de la velocidad de enfriamiento como parámetros de procesado principales. La evaporación completa del CO2 resulta en la obtención de un producto sólido poroso libre de disolventes y de impurezas. Resulta una técnica muy versátil aplicable al diseño de sistemas de diferente composición (orgánicos e híbridos), morfología (esponjas, micro y nanopartículas, monolitos), porosidad (meso y macroporosidad) y arquitectura interna (homogénea, multicapa, multicomponente). Esta Tesis Doctoral se planteó con el objetivo general de diseñar scaffolds porosos útiles en regeneración ósea. Para ello, se seleccionaron como componentes principales dos poliésteres biodegradables, la poli(-caprolactona), PCL, y el ácido poli(láctico-co-glicólico), PLGA. Se implementaron procedimientos de procesado utilizando scCO2 o CO2 comprimido para obtener tres tipos de scaffolds: (1) scaffolds de PCL y PLGA con almidón pregelificado para cesión controlada de dexametasona; (2) scaffolds de PCL conteniendo aerogeles de almidón para cesión sostenida de ketoprofeno para regeneración ósea; y (3) scaffolds de PCL y aerogeles de fibroína de seda para cesión controlada de dexametasona. De acuerdo con estos objetivos, el trabajo se llevó a cabo en tres etapas: 1. Preparación de scaffolds de PCL y PLGA con almidón pregelificado y cargados con dexametasona para regeneración ósea mediante espumado con CO2 comprimido y evaluación de su estabilidad durante el almacenamiento. Esta etapa de la Tesis se centró en dos objetivos principales: evaluar las posibilidades que ofrece la incorporación de almidón pregelificado para modular la estructura porosa y la cesión de sustancias activas a partir de los scaffolds, y obtener información sobre la estabilidad de los scaffolds en condiciones de almacenamiento controladas que reflejan las condiciones climáticas de la zona II según el International Council for Harmonization (ICH). Este último es un aspecto crítico para determinar el periodo de vida útil del scaffold una vez preparado y establecer las características requeridas para el material de acondicionamiento. No obstante, hasta la fecha se ha prestado muy poca atención a la estabilidad de los scaffolds, por lo que la información disponible es muy escasa. Para llevar a cabo este estudio se contó con la colaboración de P. Jaeger, de la compañía Eurotechnica GmbH, que evaluó la capacidad de absorción de CO2 en las matrices poliméricas empleando una balanza de suspensión magnética, y de I. Ardao del grupo BioFarma de la Universidade de Santiago de Compostela, que realizó los estudios de modelización de la cesión in vitro de la dexametasona. En primer lugar, se prepararon mezclas de PCL y PLGA (50:50) de baja viscosidad inherente con y sin almidón pregelificado y dexametasona. Las mezclas se compactaron utilizando una máquina de comprimir excéntrica para obtener compactos de 400 mg de masa (14x10x2.6 mm). A continuación, se aplicó un protocolo de espumado asistido por CO2 comprimido previamente patentado en el grupo I+D Farma, y que se adaptó a los compactos. Los compactos se expusieron a CO2 a 26 ºC y 60 bar durante 30 min. Posteriormente, la presión se redujo a 30 bar a una velocidad de 10 bar/min, y se volvió a incrementar de nuevo a 60 bar mediante la incorporación de CO2 líquido a 1 ºC. Este protocolo se repitió tres veces antes de proceder a la despresurización a 10 bar/min. Se eligieron estas condiciones de temperatura y presión suaves para hacerlas compatibles con la estabilidad de moléculas activas lábiles como la dexametasona, y también para evitar un espumado descontrolado del PLGA de baja viscosidad inherente contenido en el scaffold. A continuación, los scaffolds se caracterizaron en cuanto a características morfológicas, comportamiento frente a la temperatura, biodegradabilidad y propiedades mecánicas. El proceso de espumado hizo que el volumen de los scaffolds aumentara cuatro veces con respecto al volumen de los compactos no procesados, lo que supone valores de porosidad total de 68-75 %. Los poros presentaron dos poblaciones de macroporos, una de tamaño comprendido entre 50 y 200 µm, y otra de unas 10 µm de tamaño medio. El efecto de la composición de los scaffolds sobre la velocidad de erosión se evaluó en tampón fosfato salino de pH 7,4. La velocidad de erosión fue similar en todos los scaffolds durante los primeros 14 días, con una pérdida de peso de ~25 % y que está asociada a la degradación del PLGA. La incorporación tanto de dexametasona como de almidón pregelificado dio lugar a valores de pérdidas de masa más elevadas a partir de los 14 días, y que se justifican por la formación de poros mayores a medida que se disuelven/dispersan en el medio acuoso. Para evaluar la estabilidad, los scaffolds (no embalados) se mantuvieron en una cámara a 25 ºC y 65 % de humedad relativa, imitando las condiciones climáticas de la zona II según la ICH (Europa, Estados Unidos y Japón). Se monitorizaron los cambios en la estructura de los scaffolds, sus propiedades fisicoquímicas y mecánicas, y los perfiles de cesión de dexametasona al cabo de 1 y 3 meses. Se observaron disminuciones significativas del volumen de los scaffolds, debido a procesos de densificación, que fueron más marcadas en el caso de aquellos preparados con dexametasona y almidón. Al cabo de tres meses, los scaffolds preparados con almidón mostraron un descenso muy notable de la porosidad y el volumen total de los poros, lo que puede ser atribuido al hinchamiento de la fracción de amilopectina del almidón por efecto de la humedad. También se observaron cambios en las propiedades mecánicas y en los perfiles de cesión. En conjunto, los resultados obtenidos indican que la exposición directa de los scaffolds a 25 ºC y 65 % de humedad relativa causa efectos negativos sobre sus propiedades, de distinta magnitud dependiendo de la composición, ya que la dexametasona y el almidón conducen a estructuras menos cristalinas y más sensibles a la humedad ambiental. La velocidad de cesión de dexametasona se produce mayoritariamente por la erosión de la matriz. El posible control del almidón pregelificado sobre la cesión de la dexametasona se reduce cuando los scaffolds se almacenan durante un período de tiempo prolongado. 2. Procesado supercrítico de aerogeles de almidón y de scaffolds de PCL conteniendo aerogeles para cesión sostenida de ketoprofeno para regeneración ósea. El objetivo principal de esta etapa de la Tesis fue preparar scaffolds porosos de poli(-caprolactona), PCL, conteniendo ketoprofeno y micropartículas de aerogel de almidón. El ketoprofeno es un antiinflamatorio no esteroideo (AINE) que se administra por vía oral durante el período postoperatorio para aliviar el dolor y reducir la inflamación. El ketoprofeno no inhibe el proceso de reparación del hueso, por lo que la cesión localizada podría permitir regular la respuesta inflamatoria asociada al proceso de implantación del injerto utilizando dosis bajas y minimizando los efectos secundarios del fármaco. Por su parte, las micropartículas de aerogel de almidón se caracterizan por una elevada mesoporosidad y pueden incorporar sustancias activas. La hipótesis del trabajo fue que la incorporación de micropartículas de aerogel de almidón permitiría modular la estructura porosa del scaffold y la velocidad de cesión del ketoprofeno. Esta parte de la Tesis se llevó a cabo en colaboración con el grupo de H. C. de Sousa del Chemical Engineering Department, FCTUC, de la Universidade de Coimbra, en el marco de una estancia predoctoral de 5 meses. En primer lugar se puso a punto, por primera vez, un procedimiento de preparación de microesferas de aerogel de almidón del tamaño de una micra. Para ello se desarrolló un procedimiento de emulsión-gelificación en el que se partió de una emulsión de fase interna acuosa (dispersión de almidón al 15 %) y de fase externa oleosa (aceite de parafina) utilizando un agente emulsificante adecuado. La mezcla se llevó a autoclave, se aplicaron ultrasonidos manteniendo la mezcla a 95 ºC y después se enfrió para la completa gelificación del almidón. Las microesferas de hidrogel de almidón obtenidas se lavaron con etanol para retirar el agua y la parafina, y el alcogel resultante se secó en condiciones supercríticas para obtener las microesferas de aerogel. Parte de las microesferas se cargaron con ketoprofeno mediante impregnación supercrítica utilizando scCO2. Se prepararon lotes de scaffolds de PCL sin/con aerogel y sin/con ketoprofeno libre en el scaffold o previamente incorporado al aerogel. Las mezclas de los componentes se expusieron a scCO2 a 37 ºC y 140 bar, durante 60 min en condiciones estáticas. La despresurización se llevó a cabo a una velocidad de venteo de 1,8 g/min hasta presión atmosférica. Todos los scaffolds se caracterizaron en cuanto a sus propiedades morfológicas, fisicoquímicas y mecánicas mediante análisis de adsorción-desorción de N2, microscopía electrónica de barrido, porosimetría de intrusión de mercurio, modelado 3D, análisis mecánico dinámico y calorimetría diferencial de barrido. Los scaffolds preparados con aerogeles de almidón presentaron mayor porosidad e interconectividad de los poros, lo que facilitaría la penetración de células madre mesenquimales, aunque a costa de un pequeño debilitamiento de las propiedades mecánicas. Los estudios de cesión de ketoprofeno se llevaron a cabo sumergiendo muestras de scaffold en tampón fosfato salino de pH 7,4, en condiciones sink, a 37 ºC y bajo agitación. La monitorización de la concentración de ketoprofeno en el medio de cesión reveló que todos los scaffolds podían sostener la cesión durante varios días. No obstante, la cesión fue más rápida desde los scaffolds preparados con aerogeles de almidón, probablemente debido a la más alta accesibilidad del agua a la estructura interna del scaffold. En su conjunto, los resultados de esta etapa ponen de manifiesto que la combinación de PCL con microesferas de aerogel de almidón y el procesado de las mezclas mediante espumado supercrítico permiten obtener scaffolds cargados con ketoprofeno que cuentan con una estructura porosa adecuada para el crecimiento celular, en términos de porosidad total, distribución de tamaños de poro e interconectividad, y capaz de proporcionar perfiles de cesión sostenidos de sustancias activas. 3. Preparación de scaffolds de PCL y aerogeles de fibroína de seda con dexametasona, mediante espumado con scCO2, para regeneración ósea. En estudios previos se ha observado que la fibroína de seda promueve la adhesión y el crecimiento de células madre mesenquimales en scaffolds. Sin embargo, su utilización en forma de partículas de aerogel no ha sido investigada previamente. Por otra parte, es conocido que la dexametasona base y la dexametasona-21-fosfato de sodio presentan una solubilidad distinta en medios acuosos, lo que puede condicionar su velocidad de cesión. Tomando como base estas premisas, en la última etapa de la Tesis, se prepararon scaffolds a partir de mezclas de PCL, micropartículas de aerogel de fibroína de seda y dexametasona con el objetivo de contrastar las hipótesis siguientes: (i) las micropartículas de aerogel de fibroína de seda pueden mejorar la estructura porosa del scaffold y facilitar la infiltración celular y el transporte de fluido biológico; y (ii) la incorporación de dexametasona en forma de base o en forma de sal puede llevar a diferentes perfiles de cesión y, por lo tanto, a diferentes resultados de regeneración ósea. Para llevar a cabo este estudio se contó con la colaboración del grupo de J.L. Cenis del Instituto Murciano de Investigación y Desarrollo Agrario y Alimentario (IMIDA), que proporcionó fibroína de seda fresca obtenida en condiciones GMP, y del grupo de C. Evora de la Universidad de La Laguna, donde se llevaron a cabo los estudios in vivo. En primer lugar, se prepararon aerogeles de fibroína de seda a partir de una emulsión de fase interna disolución de fibroína de seda (8 %) y fase externa aceite de parafina, utilizando un agente emulsificante adecuado. Se ensayaron distintas condiciones de procesado y se seleccionaron las que dieron lugar a partículas de tamaño submicrométrico tras aplicar secado supercrítico. Para preparar los scaffolds, mezclas físicas de los componentes en polvo se compactaron manualmente y se expusieron a scCO2 (37 ºC, 140 bar) durante 1 hora en condiciones estáticas. A continuación, se despresurizó a una velocidad de 1.8 g/min hasta presión atmosférica. Todos los scaffolds se caracterizaron en cuanto a morfología, comportamiento frente a la temperatura, biodegradabilidad, propiedades mecánicas, modelización in silico de la infiltración celular y capacidad para regular la cesión de dexametasona y promover la osteodiferenciación celular. Los scaffolds de PCL presentaron una elevada porosidad (56-63 %), con poros en el intervalo de 100 a 200 μm de superficie lisa e interconectados. La incorporación de aerogeles de fibroína de seda dio lugar a un incremento de la porosidad, del tamaño de los macroporos, que se situó entre 150 y 400 μm, y de la rugosidad de los poros debido a la localización preferente de los aerogeles en las proximidades de su superficie. Estos cambios dieron lugar a incrementos notorios de la permeabilidad al agua y la capacidad de infiltración celular. Los perfiles de cesión resultaron ser muy dependientes de la forma química de la dexametasona (base o sal). Los scaffolds preparados con la dexametasona sal mostraron un burst en la primera hora seguido de cesión sostenida durante tres semanas. Por el contrario, los scaffolds preparados con dexametasona base proporcionaron cesión más sostenida, con perfiles ajustados a la cinética de Higuchi. Las prestaciones de los scaffolds para regeneración ósea se evaluaron in vivo utilizando un modelo murino de defecto calvar de tamaño crítico (diámetro: 8 mm). Todos los scaffolds ensayados mostraron una excelente biocompatibilidad y, en comparación con el grupo control en el que no se colocó scaffold, favorecieron la reparación del tejido dando lugar a focos de osificación. La regeneración más efectiva se observó para los scaffolds preparados con los aerogeles de fibroína de seda y dexametasona sal. Este resultado se explica por la cesión rápida de la dexametasona, con lo que se alcanzan tempranos niveles terapéuticos de fármaco tras la implantación y que se mantienen en el tiempo. En conjunto, las actividades llevadas a cabo en esta Tesis Doctoral han dado lugar a la implementación de nuevos protocolos de procesado de biomateriales y sustancias activas para la obtención de scaffolds porosos con utilidad potencial en regeneración ósea.