Estudio de la capacidad inmunoprofiláctica de proteínas recombinantes de Leishmania infantum en el modelo murino

Laburpena

SUMMARY Leishmaniasis is a spectrum of diseases caused by parasites belonging to genus Leishmania that affects millions of people in 98 countries. Every year 2 million new cases occur in humans and 350 million people are at risk of contracting leishmaniasis, predominately in tropical and subtropical regions of the planet. Different types of pathology exist depending on the parasite species but, in general, visceral leishmaniasis (VL) is the most severe. Upon infection, the parasite migrates to liver, spleen, and bone marrow producing fever, weight loss, fatigue, anaemia, splenomegaly and hepatomegaly. Every year between 200.000 and 400.000 new cases of VL are diagnosed. This disease can result in death without treatment and, even after treatment, approximately 15% of the cases are fatal. Since 2009, an outbreak of leishmaniasis has occurred in Spain due to infections with Leishmania infantum, with over of 400 confirmed cases at the present time. There are different drugs to treat the leishmaniasis but due to their high toxicity, treatment duration and parasite resistance to the available drugs, the development of effective vaccines against leishmaniasis is necessary. In this context, real time qPCR is a technique which allow us to know gene expression changes and shed light on the immune system regulation that occur during the progression of the disease. In vaccination studies or drugs test, this technique is useful for comparing quickly and accurately gene expression changes between control and treated groups. In this PhD Thesis, four proteins that are over-expressed in the infective cellular phase of the parasite L. infantum (STPKA, STPK, PP2B and PABP3) were purified to immunize BALB/c mice in order to study their protective capacity against VL. Three proteins induced a strong humoral response in mice, rLiSTPKA, rLiSTPK and rLiPABP3, but not rLiPP2B. Furthermore, the protein rLiPABP3 was the only one that induced a significant decreased of the parasite load both in spleen and liver of mice before 2 months post-infection with the parasite. In order to determine the effects of the immunisation with rLiPABP3 on the immune system of these mice, gene expression of 106 immune system-related genes was determined in the spleen of control, immunised and infected mice. The expression levels were compared with the gene expression data from control groups. The results showed that, along the whole experiment, rLiPABP3 promotes the inhibition of the inflammatory immune response in the spleen of infected mice. Furthermore, it was not observed any clearly polarized adaptive immune response to a particular cell type. One month after infection, the previously immunized animals showed over-expression of Il2rb, what makes us think that rLiPABP3 could stimulate the presence of memory T cells. In more advanced stages of infection, although we can`t observe a clear differentiation of a specific population of effector T lymphocytes, down-regulation of the gene encoding TNF-aα was observed. This finding, together with the up-regulation of gene Cxcr4 and the absence of changes in the expression of the gene Ccr7, drives us to think that immunization not only keeps the micro-architecture of the spleen, but also promotes the successful migration of DCs from the MZ to PALS, allowing the correct presentation of antigens to T cells and their subsequent activation, generating a protective immune response. On the other hand, in this Ph. D. Thesis, the best reference genes for the normalisation of high-throughput qPCR data in a murine model of VL were identified and validated. For that purpose, gene expression data from 112 genes amplified in mice were analysed using three normalization algorithms: geNorm, NormFinder and RefFinder. The genes Il2rg and Itgb2 were identified and subsequently validated as the best combination of reference genes in this model. RESUMEN Las leishmaniosis son un conjunto de enfermedades causadas por parásitos del género Leishmania que afecta a millones de personas en 98 países de todo el mundo. Cada año se producen 2 millones de nuevos casos en humanos y 350 millones de personas están en riesgo de contraer leishmaniosis, predominantemente en las regiones tropicales y subtropicales del planeta. Existen diferentes formas clínicas dependiendo de la especie de parásito implicada, pero, en general, la leishmaniosis visceral (VL) es la forma más severa. Tras la infección, el parásito migra al hígado, al bazo y a la médula ósea, produciendo fiebre, pérdida de peso, fatiga, anemia, esplenomegalia y hepatomegalia. Cada año son diagnosticados entre 200.000 y 400.000 nuevos casos de VL. Esta enfermedad puede resultar en la muerte sin tratamiento, y, aún con tratamiento, aproximadamente un 15% de los casos son fatales. Desde 2009, se ha producido en España un brote de VL y CL debido a infecciones con Leishmania infantum, con unos 400 casos confirmados hasta el momento. Existen distintos fármacos para tratar la leishmaniosis pero debido a la elevada toxicidad, duración de los tratamientos y resistencia del parásito a los fármacos disponibles, la búsqueda de vacunas efectivas contra la leishmaniosis es necesaria. En este sentido, la qPCR a tiempo real es una técnica que nos permite conocer los cambios de expresión génica y arrojar luz en la regulación del sistema inmune que se produce durante la progresión de la enfermedad. En estudios de vacunación o pruebas de fármacos, esta técnica permite comparar de forma rápida y precisa los cambios de expresión génica que se producen entre grupos control y grupos tratados. En esta Tesis Doctoral, cuatro proteínas que están sobre-expresadas en las fases infectivas del ciclo celular de L. infantum (STPKA, STPK, PP2B and PABP3) fueron purificadas para inmunizar ratones BALB/c, con el interés de estudiar su posible capacidad protectora contra la VL. Tres de ellas indujeron una fuerte respuesta humoral en los ratones, rLiSTPKA, rLiSTPK y rLiPABP3, a diferencia de la proteína rLiPP2B. Además, la rLiPABP3 fue la única que indujo una disminución significativa de la carga parasitara tanto en bazo como en hígado 2 meses después de la infección experimental con el parásito. Con el objetivo de determinar los efectos que la inmunización con rLiPABP3 tenía sobre el sistema inmune murino, se determinó la expresión génica de 106 genes relacionados con el sistema inmune en ratones control, inmunizados e infectados. Los niveles de expresión génica fueron comparados con los obtenidos para los grupos control. Los resultados mostraron que durante todo el experimento la proteína rLiPABP3 promueve la inhibición de la respuesta inmune inflamatoria en el bazo de los ratones infectados. Además, no se observa una respuesta adaptiva claramente polarizada hacia un tipo concreto. Un mes después de la infeccion, en los animales previamente inmunizados se observa la sobre-expresion de Il2rb, lo que nos hace pensar que rLiPABP3 podría estimular la presencia de linfocitos T memoria. En fases más avanzadas de la infección, a pesar de que no observamos una clara diferenciación de una población concreta de linfocitos T efectores, sí observamos la infra-expresión del gen codificante del TNF-aα, lo que unido a la sobre-expresión del gen Cxcr4 y la ausencia de cambios de la expresión del gen Ccr7 nos hace pensar que la inmunización no sólo mantiene la micro-arquitectura del bazo, sino que también promueve la correcta migración de las DCs desde la MZ hasta el PALS, permitiendo la correcta presentación de antígenos a los linfocitos T y su consiguiente activación para que se produzca la respuesta protectora observada. Por otra parte, en esta Tesis Doctoral se identificaron y validaron los genes de referencia más adecuados para la normalización de datos de qPCR a gran escala en el modelo murino de VL. Para ello se analizaron los datos de expresión génica de 112 genes amplificados en ratones utilizando tres algoritmos de normalización: geNorm, NormFinder y RefFinder. Los genes I2rg e Itgb2 fueron identificados y posteriormente validados como la mejor combinación de genes de referencia en este modelo.