Fabricación, optimización y caracterización «in vitro» e «in vivo» de biosensores amperométricos enzimáticos para determinar metabolitos energéticos (glucosa y lactato) en el sistema nervioso central

Resumo

En la presente memoria de tesis doctoral se han desarrollado microbiosensores orientados a cuantificar las concentraciones de glucosa y lactato en el espacio extracelular del sistema nervioso central de animales de experimentación. A su vez, durante el desarrollo de dichos microbiosensores, se ha realizado un estudio metodológico de las modificaciones previas con Azul de Prusia y de los protocolos de inmovilización enzimática. A modo de resumen podemos citar las siguientes conclusiones: 1)Se ha desarrollado y demostrado la idoneidad de microelectrodos de fibra de carbono de pequeñas dimensiones (¿ ~ 10 µm) modificados previamente con Azul de Prusia para detectar H2O2 a bajo potencial, lo cual permite disminuir los artefactos y la excitación neuronal derivada de aplicar elevados potenciales de trabajo. 2)Se ha estudiado y optimizado las condiciones de electrodeposición del Azul de Prusia. Los resultados mostraron que el potencial óptimo para detectar H2O2 se encuentran en el rango de +0.1 a -0.2 V frente SCE, obteniéndose una sensibilidad y un límite de detección de 1.00 ± 0.04 A M¿1 cm¿2 y 1 10¿8 M respectivamente. También se han utilizado distintos polímeros para mejorar la estabilidad y selectividad del microsensor para H2O2, encontrando idóneo para tales fines el empleo de la poli-o-fenilendiamina. 3)Se ha demostrado el efecto beneficioso del empleo de distintos surfactantes como el bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), el cloruro de bencetonio (BZTC) y el cloruro de cetilpiridinio (CPC) durante la electrodeposición de Azul de Prusia sobre tarjetas serigrafiadas. Produciendo una mejora considerable en el crecimiento del depósito, así como en la estabilidad, permeabilidad y eficiencia de transferencia de carga. Finalmente, la sensibilidad frente al H2O2 ha mejorado significativamente los valores encontrados en la literatura para configuraciones análogas. 4)Se han desarrollado protocolos de modificación y optimización para la construcción de microbiosensores amperométricos enzimáticos de primera generación para medir glucosa y lactato. El estudio concienzudo de cada una de las variables de construcción (materiales de partida, protocolos de modificación, etc.) ha permitido desarrollar microbiosensores con la sensibilidad, selectividad, tiempo de respuesta, rango lineal y límite de detección adecuados para trabajar en el SNC. 5) se ha demostrado la utilidad de los microbiosensores de glucosa y lactato elaborados mediante evaluación de la respuesta in vivo en animales de experimentación. Obteniéndose concentraciones basales para glucosa y lactato son 1.2 y 0.4 mM respectivamente, valores ampliamente recogidos en la bibliografía. Además, se comprobó la respuesta de dichos microbioensores frente a cambios en los niveles basales de glucosa y lactato mediante estimulación eléctrica local, inyección farmacológica local e intraperitoneal, administración de gases, etc. 6)Se ha resuelto el problema de la limitación estequiométrica derivada de las bajas concentraciones de oxígeno en el SNC (déficit de oxígeno) mediante el empleo de polímeros fluorocarbonados (Nafion, H700). De esta forma, se han obtenido microbiosensores de glucosa con mayor sensibilidad y un rango de trabajo óptimo para estudios fisiológicos (ver anexo II: otras publicaciones). 7) Se han realizado medidas simultáneas de la respuesta hemodinámica (flujo local sanguíneo) y de los niveles de glucosa extracelular frente a estimulación eléctrica local. El presente diseño permitió optimizar el espacio de trabajo en la ventana craneal y el estudio simultáneo de ambas variables. Los resultados mostraron una correlación positiva (R2 ~ 0.94) entre el flujo y la concentración extracelular de glucosa en el intersticio, pese a que se registró un ligero desacoplamiento entre ambas variables (ver anexo II: otras publicaciones). 8) En base a los resultados obtenidos concluimos que los microbiosensores de glucosa y lactato desarrollados y descritos en la presente memoria son adecuados para su uso en estudios neurometabólicos en el SNC de animales de experimentación.