Identificación de mutaciones en los genes clcn5 y ocrl asociadas con la enfermedad de dent y caracterización de defectos en el procesamiento del pre-arnm

Resumen

La enfermedad de Dent es una tubulopatía renal caracterizada por proteinuria de bajo peso molecular (PBPM), hipercalciuria, nefrocalcinosis, nefrolitiasis, raquitismo e insuficiencia renal. Está asociada a defectos funcionales en el gen CLCN5, (cromosoma Xp11.22), que codifica para el cotransportador de cloro ClC-5, y se expresa principalmente en el túbulo proximal. Recientemente, la enfermedad de Dent se relacionado con mutaciones en el gen OCRL1, asociado al Síndrome de Lowe. El objetivo de nuestro estudio es realizar la caracterización genética y la confirmación del diagnóstico clínico en pacientes españoles con la enfermedad de Dent mediante el análisis de los genes CLCN5 y OCRL. Por otro lado, caracterizar las nuevas mutaciones encontradas en nuestro estudio y determinar los posibles efectos de las mismas sobre el procesamiento del ARNm utilizando herramientas computacionales y análisis de ARN en muestra biológica y/o en sistemas de minigenes. Reunimos un total de 40 pacientes con diagnóstico clínico de enfermedad de Dent, todos ellos presentaban PBPM y al menos uno de los parámetros característicos de la enfermedad. Nuestro principal logro fue la confirmación genética en 34 pacientes de la presencia de mutaciones en el gen CLCN5 y de 5 pacientes a los que se encontró mutación en el gen OCRL. En la mayoría de los casos fue posible analizar al menos a un miembro de la familia del paciente, generalmente la madre, como método de validación de la mutación y con el fin de determinar la cosegregación de la variante encontrada. En muchos casos fue posible extender el análisis a los familiares disponibles, lo que nos permitió identificar a 6 varones que portaban la misma mutación que su familiar analizado; 3 de estos familiares eran ascendientes respecto a los pacientes por línea materna (dos tíos maternos y un primo de la madre) y presentaban manifestaciones clínicas propias de la enfermedad de Dent sin haber sido diagnosticados, y los otros 3 eran familiares pertenecientes a la misma generación que los pacientes (dos primos y un hermano) de los cuales no obtuvimos datos clínicos aunque presumimos que padecen la enfermedad. Además detectamos individuos femeninos portadores en heterocigosis en prácticamente todas las familias estudiadas, sin embargo, en tres de las casos analizados en nuestro estudio, dos con mutación en CLCN5 y uno con mutación en OCRL, no se detectó la mutación en la madre biológica del paciente, por lo que asumimos que estas variantes surgieron de novo como resultado de una alteración en la línea germinal materna. Hemos encontrado un total de 29 mutaciones diferentes en el gen CLCN5, 24 de las cuales han sido descritas por primera en este estudio. Del total, 9 son mutaciones de cambio de sentido, 10 son mutaciones sin sentido, 3 son mutaciones intrónicas, 6 son inserciones o deleciones y 1 es una variante compleja. Por otra parte, hemos encontrado 4 mutaciones diferentes en el gen OCRL, de las cuales 2 son nuevas. Del total, 2 son mutaciones de cambio de sentido, una es una inserción y otra es una deleción. Sólo uno de los pacientes incluidos en el estudio no presentó mutación en ninguno de los genes analizados. Existen cada vez más evidencias de que casi cualquier tipo de modificación en la secuencia de nucleótidos puede tener un efecto en el procesamiento del pre-ARNm, a través de la interrupción de las secuencias consenso involucradas, mediante la creación de nuevos sitios o el favorecimiento del uso sitios crípticos y afectando a sitios reguladores. En nuestro estudio aplicamos análisis mediante herramientas computacionales y pruebas funcionales de mutaciones tanto en CLCN5 como en OCRL, y reunimos evidencias suficientes para considerar a algunas de estas mutaciones como mutaciones de splicing.