Búsqueda de nuevos compuestos biactivos de celastraceaeaproximación biotecnológica

Resumen

No cabe duda de que la investigación en productos naturales ha contribuido considerablemente al descubrimiento de nuevas estructuras químicas no sólo con aplicaciones farmacéuticas, sino también en otros campos como productos cosméticos o de interés agrícola. Y aunque experimentó un lento declive en décadas pasadas, lo cierto es que desde el descubrimiento de los antibióticos a principios del siglo XX hasta elliptinium (un alcaloide con actividad antitumoral) aislado de Ochrosia elliptica que ha superado la investigación clínica en fase II frente al cáncer de mama humano, la investigación en productos naturales continúa teniendo un enorme potencial todavía no suficientemente explotado sobre todo, en áreas tan importantes como las de los productos antitumorales o para corregir determinados desórdenes metabólicos. Tanto es así que asistimos a un renovado interés de estos compuestos como fuente de nuevos fármacos, impulsado sobre todo por los avances en biología molecular que han permitido por un lado, la secuenciación del genoma humano con la consiguiente identificación de nuevas dianas sobre las que actuar en la lucha contra enfermedades concretas como, por ejemplo, la diabetes y la obesidad o el cáncer. Por otro lado, la secuenciación del genoma de importantes patógenos y parásitos que ha permitido la identificación de genes esenciales para su supervivencia. Un ejemplo de esto último es la secuenciación del genoma completo del agente etiológico del paludismo, Plasmodium falciparum y uno de sus principales vectores, el mosquito Anopheles gambiae, que ha permitido la aparición de nuevos instrumentos para el control de esta extendida enfermedad. A pesar de que estas expectativas también pueden ser cubiertas por los derivados de la química combinatoria o por los productos sintéticos o semisintéticos. Los Productos Naturales (PN) presentan una doble ventaja: Por un lado, destaca su enorme diversidad química que favorece el hallazgo de nuevos candidatos como agentes terapéuticos y, por otro, el hecho de que han co-evolucionado con proteínas y otras macromoléculas y ello aumenta la probabilidad de su interacción con ellas. No obstante, el principal problema del desarrollo de fármacos a partir de esto compuestos sigue residiendo en su productividad. Para solventarlo se plantean distintas alternativas: Síntesis química, pero que en el caso de la mayoría de los PN resulta costosa y complicada debido al elevado de centros estereogénicos que poseen. Síntesis o semisíntesis a partir de un precursor de más fácil obtención o que se encuentre en mayor cantidad. Pero esto no siempre es posible. También se han explorado las posibilidades de la Ingeniería genética que permite entre otras cosas, transferir a hongos y bacterias los genes que confieren a la planta la capacidad de producir el compuesto de interés. Ante todo esto, un de las alternativas que se presenta como la más viable, es el desarrollo de cultivos celulares sobre todo en aquellos casos en que la planta sea difícil de cultivar o tenga un largo período de crecimiento y que el metabolito se produzca en baja cantidad o que su síntesis curse con un alto costo o bajo rendimiento. Además, si este metabolito es producido por la raíces de la planta, estos cultivos celulares encuentran una ventaja añadida en la inducción de Raíces en Cabellera (RC). En lo que se refiere a la investigación de productos naturales, la familia Celastraceae resulta bastante significativa, debido a que presenta numerosas especies conocidas por su uso en la medicina tradicional lo que hace que sea considerada como una fuente de importantes metabolitos bioactivos. Esta familia está compuesta por 106 géneros y 1300 especies distribuidas pantrópicamente, aunque un elevado número de ellas se localizan en climas cálidos y cálido-templados. Estudios fitoquímicos realizados en distintas especies de esta familia han dado como resultado el aislamiento de un gran número de metabolitos secundarios de gran interés donde destacamos los Triterpeno, no sólo por el amplio rango de actividades que presentan, sino porque se han utilizado como estructuras de partida para modificaciones químicas. Sesquiterpenos ß-dihidroagarofuránicos destacables por sus actividades biológicas y porque se consideran indicadores quimiotaxonómicos de la familia Celastarceae. Ante estos antecedentes nos pareció interesante continuar con la búsqueda de nuevos compuestos bioactivos de esta familia, así como explorar tentativamente las posibilidades biotecnológicas que ofrece. Los resultados y la conclusiones obtenidas se presentan organizados 5 capítulos que hemos denominados: Capítulo I: Estudio fitoquímico de las raíces de Plenckia integerrima ¿ Del extracto de n-hexano de las raíces de Plenckia integerrima se aislaron un total de siete terpenos que fueron identificados por comparación con datos físicos y espectroscópicos publicados como tingenona, 6-oxo-pristimerol, netzahualcoyeno, zeylasteral, netzahualcoyonol, dihidrotingenol y escutiona. ¿ Del extracto de etanólico de las raíces de Plenckia integerrima se aislaron un total de ocho compuestos, siendo cuatros de ellos conocidos e identificados como el azúcar ramnosa, el triterpeno 6-oxo-pristimerol y los sesquiterpenos agarofuránicos macrocíclicos evonimina y cangorinina E-I. Los cuatro restantes, resultaron ser sesquiterpenos agarofuránicos no descritos anteriormente en la bibliografía. ¿ En base a un cuidadoso análisis espectroscópico las estructuras de los productos no descritos anteriormente fue establecida como: PI-1: (1R, 2S, 4S, 5S, 6R, 7R, 8R, 9S, 10S)-1-benzoiloxi-6,8-diacetoxi-2,9-dinicotinoiloxi-ß-dihidoagarofurano. PI-2: 1ß, 15-diacetoxi, 2¿-nicotinoiloxi, 4ß, 6ß, 8ß-trihidroxi, 9¿-benzoiloxi-ß-dihidroagarofurano. PI-3: 1¿, 2¿, 6ß, 8ß, 9¿-pentacetoxi, 4ß-hidroxi, 15-isobutiroxi, 3ß, 13-evoninato-ß-dihidroagarofurano. PI-4: 1¿-2metilbutiroxi, 2¿, 6ß, 8ß, 9¿, 15-pentacetoxi, 4ß-hidroxi, 3ß, 13-9'acetoxiwilfordato-ß-dihidroagarofurano. ¿ Se estableció la configuración absoluta de PI-1, mediante la técnica de dicroísmo circular. Capítulo II: Estudio fitoquímico de las raíces de Maytenus ilicifolia ¿ Tras sucesivas cromatografías del extracto de las raíces de M. ilicifolia se aislaron diez compuestos. Ocho de ellos resultaron conocidos y fueron identificados como: 7,8 dihidro-escutidina ¿B, 7,8 dihidroisoxuxuarina E¿6, 6 oxo-pristimerol, tingenona, cheilocline D, ß-sitoesterol, pristimerina y netzahualcoyeno. Los otros cuatro compuestos resultaron ser nuevos en la bibliografía y han sido denominados como milicifilina A (vainillato de 6-oxo-tingenol), milicifolina B (aducto sesquiterpeno-triterpeno, donde la unidad triterpénica es de la serie de la tingenona y la sesquiterpénica, deriva del guayano), milicifolina C (aducto sesquiterpeno-triterpeno, donde la unidad triterpénica presenta un esqueleto de 6-oxo-tingenol y la sesquiterpénica, deriva del guayano) y milicifolina D (dímero de triterpenos donde la unidad fenólica es pristimerol y la unidad quinónica, es tingenona). ¿ En el caso de los aductos sesquiterpenos-triterpenos milicifolina B y C, los intentos de cristalización en diferentes disolventes no condujeron a cristales adecuados para una difracción de rayos X óptima. Cómo los triterpenos son aislados como productos quirales en una única serie enantiomérica, se pudo establecer la estereoquímica absoluta de los carbonos C-1' y C-5' en base a los efectos NOE detectados. Así, los compuestos milicifolina B y C presentan la configuración (1'S, 5'S). Capítulo III: Estudio fitoquímico de las hojas de Maytenus spinosa ¿ Del extracto de las hojas de M. ilicifolia se aislaron 3 triterpenos con esqueleto de lupano identificados como lupeol, lupenona y betulina, once sesquiterpenos ß-dihidroagarofuranos de los cuáles diez resultaron ser nuevos para la bibliografía científica (MS 1-10) y el otro, 1¿, 2¿, 6ß, 9¿, 15¿-pentacetoxi, 8¿-benzoiloxi-ß-dihidroagarfurano, resultó ser conocido. Además también se purificaron ocho sesquiterpenos ß-dihidroagarofuranos macrocíclicos, de los cuales tres se identificaron como wilfordine E, evonoline y evononine y los otros cinco, que denominamos MS 11-15, presentaron una estructura novedosa. ¿ Tras un detallado análisis espectroscópico de los sesquiterpenos ß-dihidroagarofurano no macrocíclicos no descritos en la bibliografía, se establecieron sus estructuras como: MS-1: 1¿, 2¿, 9ß, 15 tetracetoxi-8ß benzoiloxi-ß-dihidroagarofurano. MS-2: 1¿-benzoyl, 2¿, 6ß, 8¿-triacetoxi, 9¿-metilbutiroxi-ß-dihidroagarofurano. MS-3: 1¿, 6ß-diacetoxi, 2¿, 8¿, 9¿-tribenzoiloxi-ß-dihidroagarofurano. MS-4: 1¿-benzoiloxi, 2¿, 6ß, 8¿, 9¿-tetraacetoxi-ß-dihidroagarofurano. MS-5: 1¿, 6ß, 8¿-triacetoxi, 2¿-hidroxi, 9¿-benzoiloxi-ß-dihidroagarofurano. MS-6: 1¿, 6ß, 15-triacetoxi, 2¿-hidroxi, 8¿-metilbutiroxi, 9¿-benzoiloxi-ß-dihidroagarofurano. MS-7: (1R, 2S, 4R, 5S, 6R, 7R, 8R, 9S, 10S)-8, 9-dibenzoiloxi, 1, 6-diacetoxi, 2-hidroxi-ß-dihidoagarofurano. MS-8: 1¿, 6ß, 15-triacetoxi, 2¿-hidroxi, 8¿, 9¿ dibenzoiloxi-ß-dihidroagarofurano. MS-9: 1¿, 6ß, 8ß, 15-tetracetoxi, 2¿-hidroxi, 9¿ benzoiloxi-ß-dihidroagarofurano. ¿ La configuración absoluta de MS-7 se estableció mediante la técnica de dicroísmo circular. ¿ Se describieron las estructuras de los sesquiterpenos ß-dihidroagarofurano macrocíclicos que resultaron nuevos como: MS-10: 1¿, 2¿, 8¿, 9¿, 15-pentacetoxi, 4ß-hidroxi, 6ß-benzoiloxi, 3ß, 13-wilfordato-ß-dihidroagarofurano. MS-11: 1¿, 2¿, 9¿, 15-tetracetoxi, 4ß, 6ß-dihidroxi, 8-cetoxi, 3ß, 13-isowilfordato-ß-dihidroagarofurano. MS-12: 1¿, 2¿, 6ß, 8ß, 9¿, 15-hexacetoxi, 4ß-hidroxi, 3ß, 13-wilfordato-ß-dihidroagarofurano. MS-13: 1¿, 2¿, 9¿, 15-tetracetoxi, 4ß, 6ß, 8ß-trihidroxi, 3ß, 13-isowilfordato-ß-dihidroagarofurano. MS-14: 1¿, 2¿, 8ß, 9¿, 15-pentacetoxi, 4ß, 6ß-dihidroxi, 3ß, 13-isowilfordato-ß-dihidroagarofurano. Capítulo IV: Evaluación de la capacidad anti-VIH de triterpenos y sesquiterpenos ¿ A partir del sesquiterpeno ß-dihidroagarofurano macrocíclico MS-14 se prepararon siete derivados mediante reacciones de acilación y oxidación del grupo hidroxilo en posición 6. ¿ A partir del triterpeno lupeol se prepararon ocho derivados mediante modificaciones del grupo hidroxilo en posición 3, oxidaciones alílicas del doble enlace en posición 20 y por epoxidación del doble enlace C-20, C-29. ¿ Los compuestos de esqueleto sesquiterpenos ß-dihidroagarofurano preparados y algunos naturales fueron ensayados como agentes inhibidores de la infección del VIH-1. De entre todos ellos, resaltaron los porcentajes de inhibición de MS-1 y de cangorinine E-I. Estos resultados, nos permitieron establecer algunas relaciones estructura-actividad preliminares que favorecen la actividad anti-VIH. ¿ A partir de la betulina se preparó un derivado mediante la oxidación alílica del doble enlace en posición 20 ¿ Los compuestos de naturaleza triterpénica se ensayaron como agentes antifusogénicos y se determinó así la capacidad de inhibición de entrada del virus VIH en la célula hospedadora. Sólo cuatro de ellos mostraron una actividad antifusogénica de interés, donde destacan L-3, L-5 y L-6 que interaccionan con CCR5 y bloquean la fusión celular mediada por envueltas R5 trópicas. A partir de estos resultados obtenidos se determinaron algunos requerimientos estructurales necesarios para la actividad. Capítulo V: Exploración de las posibilidades biotecnológicas del género Maytenus ¿ Se estableció un protocolo de esterilización y geminación de semillas de Maytenus canariensis, donde resultó imprescindible el uso de ácido sulfúrico para romper la dormancia de las mismas. ¿ Se estableció un eficiente protocolo de micropropagación para M. canariensis que permite la generación de nuevas plantas desarrolladas en un período aproximado de 10-12 meses. ¿ Se estableció una estrategia de inducción de raíces en cabellera en plántulas generadas in vitro de M. canariensis, mediante la infección guiada con diferentes cepas de Agrobacterium rhizogenes. ¿ A pesar de los números esfuerzos llevados a cabo, no se pudo establecer el cultivo de raíces en cabellera de la especies M. canariensis. Posiblemente esto se deba a la propia naturaleza de la especie, ya que al ser una planta leñosa se dificulta e incluso se imposibilita el establecimiento de este tipo de cultivos.