Mecanismo de accion de triterpenoquinonas de celastraceas

Resumen

Es objetivo de este trabajo estudiar la actividad antimicrobiana y el mecanismo de acción del celastrol, así como llevar a cabo un estudia SAR de triterpenoquinonas aisladas de cleastraceas.El celastrol al igual que otros celastroloides es una sustancia de espectro medio, siendo activo sólo sobre las bacterias Gram positivas y que el grupo carboxilo en el anillo E de la molécula es fundamental para la actividad. De hecho, cuando éste es bloqueado su potencia antibiótica se ve reducida considerablemente como es el caso de la sal sódica del celastrol, o bien en la pristimerina que carece de actividad frente a S. aureus, pero no así frente a las bacterias esporuladas como B. subtilis, lo que nos sugiere que la diana en ambas bacterias debe de ser diferente. Los estudios realizados para elucidar su mecanismo de acción sobre las bacterias sensibles como B. subtilis (ejemplo de bacterias esporuladas), S. epidermidis y S. aureus, mostraron que el celastrol produce un rápida inhibición de la síntesis de peptidoglicano y de ADN en S. aureus y más tardíamente de ARN y proteínas. La capacidad de afectar a todos los procesos sería indicativo de sustancias que actúan a nivel de la membrana citoplasmática y como consecuencia de su interacción, podría verse afectado el transporte de solutos a través de ella. En efecto, el celastrol produjo una disminución significativa de la captación de los precursores al citosol, y como consecuencia tuvo lugar la inhibición de la síntesis macromolecular, no debiéndose por tanto a una acción directa del celastrol sobre alguno de los procesos. Además una ligera liberación del precursor marcado fue también detectada, como consecuencia de un daño en la membrana citoplasmática, debido probablemente al tratamiento simultáneo del celastrol y el antibiótico específico de inhibir la síntesis de ADN (ciprofloxacina) y pared celular (vancomicina). Por otra parte, una desorganización de la membrana citoplasmática es a menudo evidenciada por una liberación de constituyentes celulares, incluyendo el ión K+, como primer índice de daño de membrana. Nuestros resultados revelaron que el celastrol produjo en S. aureus un marcado eflujo de potasio intracelular después de 30 minutos y una inhibición de la oxidación del NADH y de la respiración celular en células intactas y en preparaciones subcelulares de las bacterias sensibles a su acción y de E. coli, lo que nos confirma que la insensibilidad de las bacterias Gram negativas pueda deberse a la membrana externa. Por otra parte, la no liberación de constituyentes que absorben en la zona ultravioleta y la fluorescencia verde detectada incluso a concentraciones de 30microgr/ml, así como la presencia de mesosomas en las células tratadas, los cuales son consideradas como un indicativo de alteración de membrana, nos refuerzan la hipótesis de que el celastrol actúa sobre la membrana citoplasmática de S. aureus y no provoca un daño en ella, pero si altera sus funciones. Si comparamos la actividad del celastrol frente a B. subtilis, en relación a los resultados obtenidos frente al coco, podemos decir, que el bacilo es más sensible a la quinona, teniendo un comportamiento diferente según el tamaño de la población y de la fase de crecimiento en que ésta se encuentre. Así, el celastrol actúo como una sustancia bactericida a tamaños de inóculo menores o iguales a106 u.f.c./ml, mientras que a densidades celulares de 107u.f.c./ml fue bacteriostático, no obstante a la misma concentración celular el efecto del celastrol fue más acusado cuando las células estaban dividiéndose activamente. Por el contrario frente a S. aureus, el celastrol siempre se comportó como una sustancia bacteriostática independientemente del tamaño de la población sometida a su acción y su efecto no se vio incrementado cuando las células estaban dividiéndose activamente. Los estudios de la síntesis macromolecular verificaron que al igual que en S. aureus, el celastrol produjo una inhibición de todos los procesos, aunque no de manera simultánea , siendo los primeros procesos en ser bloqueados la síntesis de ADN y ARN entre los 5 y 10 minutos y un menor efecto fue observado en la incorporación de leucina y N-acetil-D-glucosamina. El hecho de que en ambas bacterias, la síntesis de ADN sea uno de los primeros procesos en ser bloqueado, nos lleva a plantearnos si el celastrol al igual que antibióticos peptídicos y fenólicos presenten múltiples dianas de acción. En apoyo de esta idea, está el hecho de que el celastrol fue capaz de inhibir la girasa a 50 microgr/ml y según los trabajos de Campanelli, por técnicas espectroscópicas, ponen en evidencia que la tingenona interactúa con el ADN lo que da lugar a un aumento de la Tm del mismo, sugiriendo que dicha unión se produciría mediante la formación de puentes de hidrógeno adicionales entre los grupos hidroxilo de la tingenona en el anillo A, que también posee el celastrol y en general este tipo de celastroloides, y los grupos fosfato del ADN. Además, trabajos posteriores por modelización molecular mostraron que las triterpenometilénquinonas se intercalan al ADN a través del sistema carbonilo insaturado localizado en estructura planar de los anillos A y B, seguido de un ataque nucleofílico, lo que llevaría a la alcalinización de las bases del ADN, y a un bloqueo del proceso de replicación. En lo que a S. epidermidis se refiere, destacar que el celastrol actuando al igual que frente a S. aureus como una sustancia bacteriostática, al cabo de las 24 h produjo una reducción mayor a 3Log10 en el número de unidades viables, teniendo un comportamiento bactericida, independientemente de la concentración empleada y el tamaño de la población sometida a su acción. Al igual que en S. aureus, el primer proceso en ser bloqueado fue la síntesis del peptidoglicano, mientras que no se alcanzó el 60% de inhibición de la síntesis de ADN. Sin embargo, el celastrol no produjo un bloqueo en la captación de solutos, ya que de hecho no se vio interrumpida en ningún momento, pues el número de cuentas asociadas a las células fue aumentando progresivamente con el tiempo, aunque ésta fue menor que la detectada en las células sin tratar. Estos resultados nos sugieren que el mecanismo de acción del celastrol sobre S. epidermidis debe ser diferente al presentado frente a las otras dos bacterias Gram positivas. Además, no provoco la liberación intracelular de K+, aunque si una muy moderada liberación de materiales que absorben a 260 nm, así como un daño en la membrana medido por el método del BacLight tras una prolongada exposición (60 minutos) de las células al celastrol a altas concentraciones, que estuvo acompañada de una reducción de 1 Log10 en el número de unidades viables, lo que nos indicaría que frente a esta bacteria el celastrol provoca un daño en la membrana citoplasmática y que es dependiente de la concentración y del tiempo de exposición.