Expresión y regulación de las taquicinas en células del sistema inmuneimplicación en el inicio y/o progresión del asma

  1. Tilman Eike Klassert
Supervised by:
  1. Teresa Acosta Almeida Director
  2. Mariano Hernández Ferrer Director

Defence university: Universidad de La Laguna

Year of defence: 2010

Committee:
  1. María Luz Candenas de Lujan Chair
  2. Jose Antonio Pérez Pérez Secretary
  3. Juan José Sánchez Sánchez Committee member
  4. Margarita Prunell Tuduri Committee member
  5. Francisco Pinto Perez Committee member
Department:
  1. Bioquímica, Microbiología, Biología Celular y Genética

Type: Thesis

Abstract

EXPRESIÓN, REGULACIÓN Y MECANISMOS DE SEÑALIZACIÓN DE LAS TAQUICININAS EN CÉLULAS DEL SISTEMA INMUNE: IMPLICACIÓN EN EL INICIO Y/O PROGRESIÓN DEL ASMA. INTRODUCCIÓN Las taquicininas constituyen una familia de péptidos cuyos principales miembros son la sustancia P (SP), la neurocinina A (NKA), la neurocinina B (NKB) y la recientemente identificada hemocinina-1 (HK-1) (Kang y cols., 2004; Page, 2004; Zhang y cols., 2006). Por definición, estos peptidos comparten una región hidrofóbica C-terminal conservada, Phe-X-Gly-Leu-Met-NH2, donde X es siempre un residuo hidrofóbico (Casale, 1991; Maggi y cols., 1995). En humanos, los genes que codifican estos péptidos son tres: TAC1, que codifica para la substancia P (SP) y la neurocinina A (NKA), TAC3 que codifica para la neurocinina B (NKB), y TAC4 que codifica para la hemocinina (HK-1) y sus formas extendidas denominadas endocininas A, B, C y D (EKA, EKB, EKC y EKD) (Kang y cols., 2004; Page, 2004; Zhang y cols., 2006; Almeida y cols., 2004). Las taquicininas ejercen su acción principalmente a través de la unión con tres receptores acoplados a proteínas G, denominados NK-1, NK-2 y NK-3 (Gerard y cols., 1993). Aunque las taquicininas naturales parecen poder interaccionar indistintamente con varios de los receptores taquicinérgicos, las mayores afinidades se observan entre NK1R y SP, NK2R y NKA, y NK3R y NKB (Almeida y cols., 2004). La acción de estos péptidos en nuestro organismo estará en función de la localización tanto de las taquicininas como de sus receptores. En este sentido, y sobre todo con el descubrimiento de las endocininas, está cambiando el concepto de las taquicininas como meros neurotransmisores restringidos a tejidos neuronales (Almeida y cols., 2008). Las taquicininas han sido relacionadas con multitud de funciones y afecciones. Entre ellas cabe destacar su aparente implicación en el desarrollo de diversos desordenes psiquiátricos como son la ansiedad y la depresión, así como la respuesta al estrés (Massi y cols., 2000). Además se ha observado su acción sobre diversos órganos y tejidos, desde el estómago e intestino, hasta el útero (Patacchini & Maggi, 2001), siendo sin embargo, la relación entre taquicininas y las vías respiratorias la más documentada (Patacchini & Maggi, 2001; De Swert & Joos, 2006). Una gran cantidad de estudios funcionales demuestran el papel de las taquicininas, y especialmente de SP, en el inicio y desarrollo de procesos inflamatorios (O'Connor y cols., 2004; De Swert & Joos, 2006). SP es capaz de inducir la liberación de mediadores inflamatorios como citoquinas, radicales de oxígeno, derivados del ácido araquidonico e histamina, amplificando así la respuesta inflamatoria (O'Connor y cols., 2004). Además, SP provoca vasodilatación local, quimiotaxis y adhesión de leucocitos al endotelio vascular, lo que genera extravasación, migración y acumulación de leucocitos en el sitio de la inflamación. (De Swert & Joos, 2006; Zhang y cols., 2006). Por otro lado, NKA manifiesta un efecto broncoconstrictor de 2 a 3 órdenes de magnitud superior al de la histamina o al de la acetilcolina, siendo por tanto el broncoconstrictor más potente de la musculatura lisa en los pulmones (Advenier y cols., 1992). Respecto a NKB, se ha visto su implicación en la quimiotaxis de células inflamatorias, así como en la hiperrespuesta bronquial y extravasación de plasma en los pulmones de diversos modelos animales de asma (Daoui et al., 2000, Nenan et al., 2001; Grant et al., 2002). Por otro lado, la recientemente descubierta HK-1 es un potente agonista del receptor NK-1, cuya implicación con el asma esta bien documentada (Joos et al., 2000; Schuiling et al., 2001). De hecho, se ha especulado que HK-1 pudiera ejercer algunas de las funciones atribuidas a SP en el proceso inflamatorio (Page et al., 2003). La expresión de TAC1 se ha observado en linfocitos (Lai y cols., 1998) y monocitos/macrófagos (Ho y cols., 1997), y se ha detectado la presencia de la proteína SP en eosinófilos y neutrófilos (Aliakbari y cols., 1987). Respecto a la relación entre las fibras sensoriales que producen SP (fibras C) y las células hematopoyéticas que expresan TAC1, existen experimentos en ratón que demuestran la enorme sinergia entre ambos sistemas con respecto a la inflamación mediada por neuropéptidos (Chavolla-Calderon y cols., 2003). En comparación con la gran cantidad de información estructural y funcional de la que se dispone acerca de la implicación de SP/NKA en el proceso inflamatorio y el asma, poco se sabe del papel de la tercera neurocinina (NKB) y de la recientemente descubierta hemocinina-1. MEMORIA El objetivo del presente trabajo fue el de ampliar la información sobre el papel de las taquicininas en el desarrollo y progresión del asma. En un principio el trabajo se centró sólo en el papel de la Neurocinina-B, pero en el desarrollo del mismo se fue ampliando el espectro para abordar el papel de los 3 genes taquicinérgicos y sus productos proteicos en el desarrollo de esta patología. Para determinar la implicación de las taquicininas en el asma se fijaron objetivos para estudiar diferentes aspectos sobre la expresión, la regulación y los mecanismos de señalización de las taquicininas en relación con el desarrollo del asma. Así, en primer lugar nos propusimos estudiar los patrones de expresión de los genes TAC3 y TAC4, así como la proteína NKB, en las células inmunes humanas extraídas de sangre periférica. Tras la extracción de sangre periférica de individuos sanos, se procedió al aislamiento de linfocitos, monocitos, neutrófilos y eosinófilos. Todas estas fracciones celulares fueron sometidas a extracción del ARN total, y mediante RT-PCR se obtuvo el ADN complementario (ADNc) correspondiente. En cada una de estas líneas celulares se determinó la presencia de la proteína NKB y el patrón de expresión de los genes taquicinérgicos TAC3 y TAC4 utilizando para ello anticuerpos y cebadores específicos. Además, se extrajo sangre periférica de individuos sanos y asmáticos, a fin de comparar los niveles de expresión de dichos genes entre ambos grupos mediante PCR a tiempo real. Por otro lado, se procedió a la búsqueda de variables genéticas de los genes taquicinérgicos TAC1, TAC3 y TAC4, a fin de determinar si existe un componente genético en los mismos que pueda implicar una posible predisposición a la patología. En total, se seleccionaron 28 polimorfismos (SNPs) desde la base de datos del HapMap Project. Mediante la técnica SNaPshot, un total de 202 individuos (102 asmáticos y 100 controles) fueron genotipados previa obtención del correspondiente número de muestras de sangre periférica. Los datos obtenidos fueron analizados con las herramientas estadísticas apropiadas (Haploview v3.3, 2006, SNAPstats, ICO). A fin de estudiar el efecto de las taquicininas sobre células implicadas en los procesos inflamatorios, como los eosinófilos, se realizaron ensayos in vitro con la línea celular EoL-1, que fue previamente diferenciada mediante incubación con db-AMPc durante 9 días. Una vez optimizadas las condiciones de estimulación con las taquicininas (SP, NKA, NKB y HK-1), los cultivos celulares fueron tratados simultáneamente con el neuropéptido y antagonistas de los diferentes receptores taquicinérgicos, para determinar con qué receptor está interactuando el neuropéptido. Tras las diferentes exposiciones extrajimos el ARN total de las células para el análisis de la expresión de más de 50 genes asociados con el desarrollo del proceso inflamatorio en asma. RESULTADOS Como primer resultado del presente trabajo, hemos determinado por vez primera la expresión diferencial de los genes taquicinérgicos en estudio (TAC3 y TAC4) en diferentes estirpes celulares (neutrófilos, linfocitos, monocitos y eosinófilos), obtenidas a partir de sangre periférica de siete donantes sanos. Además, se obtuvo una fracción enriquecida de linfocitos-T mediante cultivo durante 72 horas en presencia del mitógeno fitohemaglutinina (PHA). El uso de cebadores específicos para cada gen y tránscrito nos permitió detectar la expresión de TAC3 en monocitos, linfocitos y PHA-linfocitos. Por otro lado, diferentes tránscritos de TAC4 fueron detectados en neutrófilos, eosinófilos, linfocitos y PHA-linfocitos. Además, la comparación mediante PCR a Tiempo Real de la expresión de TAC3 y TAC4 entre linfocitos y linfocitos estimulados con PHA, mostró una clara sobreexpresión de TAC3 y una inhibición en la expresión de TAC4 tras el cultivo de los linfocitos con PHA. Paralelamente, también se determinó la presencia de la proteína NKB, mediante técnicas inmunocitoquimicas, en neutrófilos, eosinófilos, monocitos y linfocitos. La búsqueda de variables genéticas de los genes taquicinérgicos TAC1, TAC3 y TAC4, que pudieran estar asociadas a la susceptibilidad de padecer asma, mostró asociación significativa de dos SNPs con esta patología: uno localizado en la región promotora de TAC3 confiriendo protección frente al asma (Odds ratio [OR]: 0.46; 95% CI:0.22-0.97; p=0.038), y otro SNP en TAC4 asociada con un riesgo de padecer la enfermedad (OR: 1.94; 95% CI: 1.06-3.54; p=0.03). Los resultados en este estudio han sido publicados en el Journal of Neuroimmunology (Klassert y cols, 2010). Los datos obtenidos en los ensayos in vitro con EoL-1 de estimulación con taquicininas, mostraron cambios en la expresión de hasta 12 genes pro-inflamatorios implicados en el metabolismo de diversos mediadores en el asma. Los resultados son objeto de la elaboración de un nuevo artículo que será publicado en breve. DISCUSIÓN En este trabajo hemos demostrado por vez primera la presencia de ARNm de TAC3 y TAC4, así como la proteína NKB en diferentes células inmunes extraídas de sangre periférica. Las células analizadas en el presente estudio incluyeron polimorfonucleares (PMN), eosinófilos, monocitos y linfocitos. Aunque PMN y eosinófilos no mostraron niveles de expresión detectables de TAC3, todas las células estudiadas mostraron inmunoreactividad para dos anticuerpos policlonales frente a NKB. Por otro lado, diferentes tránscritos de ARNm de TAC4 fueron detectados en todas las células, excepto en monocitos. Las taquicininas constituyen la base de comunicación en el eje neural-inmuno-hematopoyético. (Greco y cols., 2004). Entre estas, SP ha sido la más extensamente estudiada, mostrando un papel importante como regulador de funciones inmunes y procesos inflamatorios (Zhang y cols., 2006). Este péptido, así como el ARNm de TAC1 estan extensamente expresados en tejidos neuronales y no-neuronales, tanto a nivel central como periférico (Almeida y cols., 2004). Por el contrario, el papel fisiológico de NKB es menos conocido, y durante muchos años se pensó que la presencia de este péptido estaba restringida al sistema nervioso central (Almeida y cols., 2004). Sin embargo, estudios recientes han mostrado la expresión de ARNm de TAC3 en la periferia, en diferentes tipos de células reproductivas y eritroides (Pinto y cols., 2004). En el presente estudio hemos demostrado su expresión constitutiva en células inmunes de los linajes mieloide (monocitos) y linfoide (linfocitos). Además, observamos inmunoreactividad para NKB en todos los tipos celulares analizados, incluyendo los PMN y eosinófilos, donde no pudimos detectar transcripción de TAC3. Este hecho puede explicarse por la regulación de la expresión a nivel de ARNm de diferentes genes observada durante la diferenciación de diversos tipos celulares (Gruart y cols., 1992). Por otro lado, se llevó a cabo un estudio de asociación a fin de buscar variables en los genes taquicinérgicos TAC1, TAC3 y TAC4 que pudieran estar asociados con la suceptibilidad a asma. A pesar de las abundantes evidencias de la implicación de las taquicininas en el desarrollo del asma (Joos y cols., 2000), nunca se había realizado un estudio de asociación entre esta patología y polimorfismos de los genes taquicinérgicos. Los resultados de dicho estudio apuntan a una posible asociación de dos SNPs de los genes TAC3 y TAC4 con el asma. Estos dos genes están localizados en las regiones cromosómicas 12q13.3 y 17q21.33, respectivamente. Curiosamente, estudios de barrido genómico han mostrado asociación y ligamiento de estas regiones genómicas con el asma bronquial y fenotipos relacionados en diferentes poblaciones (Shao y cols., 2004; Bisgaard y cols., 2009). El SNP de TAC3 que mostró asociación significativa con la enfermedad está localizado en el promotor proximal del gen, en el exón I, cerca de un elemento silenciador restrictivo de neuronas (REST), que recientemente ha demostrado regular la transcripción de TAC3 (Gillies y cols., 2009). Por otro lado, el SNP de TAC4 esta localizado en un intrón del gen, por lo que cualquier posible efecto de este SNP en la expresión del gen está aún por determinar. Sin embargo, estudios previos con otros genes ya han demostrado la capacidad de SNPs intrónicos de regular el procesamiento del ARN y la expresión génica (Shima y cols., 2006). Además, en el caso concreto del SNP de TAC4, éste se encuentra localizado en un lugar de unión potencial de CTCF (CGGGAAGAGG), y la regulación de la expresión génica por CTCF ha sido documentada para dianas intrónicas en estudios previos (Arnold y cols., 2000). Los resultados obtenidos tanto en los estudios de asociación cómo en los ensayos in vitro con la línea celular eosinofílica, refuerzan aún más las evidencias de la implicación de las taquicininas en procesos inflamatorios como el asma. REFERENCIAS Advenier, C.; Naline, E.; Toty, L.; Bakdach, H.; Emonds-Alt, X.; Vilain, P.; Breliere, J.C. and Lefur, G. 1992. Effects on the isolated human bronchus of SR48968, a potent and selective nonpeptide antagonist of the neurokinin A (NK2) receptors. Am. Rev. Respir. Dis. 146: 1177-1181. Aliakbari, J., Sreedharan, S.P., Turck, C.W., Goetzl, E.J., 1987. Selective localization of vasoactive intestinal peptide and substance P in human eosinophils. Biochem. Biophys. Res. Commun. 148, 1440-1445. Almeida, T.A.; Rojo, J.; Nieto, P.M.; Hernandez, M.; Martin, J.D.; Cadenas, M.L. 2004. Tachykinins and tachykinin receptors: Structure and activity relationships. Current Med. Chem. 11: 2045-2081. Arnold, R., Mäueler, W., Bassili, G., Lutz, M., Burke, L., Epplen, T.J., Renkawitz, R. 2000. The insulator protein CTCF represses transcription on binding to the (gt)(22)(ga)(15) microsatellite in intron 2 of the HLA-DRB1(*)0401 gene. Gene. 253, 209-214. Bisgaard, H., Bønnelykke, K., Sleiman, P.M., Brasholt, M., Chawes, B., Kreiner-Møller, E., Stage, M., Kim, C., Tavendale, R., Baty, F., Pipper, C.B., Palmer, C.N., Hakonarsson, H. 2009. Chromosome 17q21 gene variants are associated with asthma and exacerbations but not atopy in early childhood. Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 179, 179-185. Casale, T.B. 1991. Neuropeptides and the lung. J.Allergy Clin. Immunol. 84: 1-14. Chavolla-Calderón, M.; Bayer, M.K.; Fontán, J.P. 2003. Bone marrow transplantation reveals an essential synergy between neuronal and hemopoietic cell neurokinin production in pulmonary inflammation. J. Clin. Investigation 111: 973-980. Daoui, S., Naline, E., Lagente, V., Emonds-Alt, X., Advenier, C. 2000. Neurokinin B- and specific tachykinin NK(3) receptor agonists-induced airway hyperresponsiveness in the guinea-pig. Br. J. Pharmacol. 130, 49-56. De Swert, K.O., Joos, G.F., 2006. Extending the understanding of sensory neuropeptides. Eur. J. Pharmacol. 533, 171-181. Gerard, N.P., Bao, L., Xiao-Ping, H., Gerard, C., 1993. Molecular aspects of the tachykinin receptors. Regulatory Peptides 43, 21-35. Gillies, S., Haddley, K., Vasiliou, S., Bubb, V.J., Quinn, J.P. 2009. The human neurokinin B gene, TAC3, and its promoter are regulated by Neuron Restrictive Silencing Factor (NRSF) transcription factor family. Neuropeptides. 43, 333-340. Grant, A.D., Akhtar, R., Gerard, N.P., Brain, S.D. 2002. Neurokinin B induces oedema formation in mouse lung via tachykinin receptor-independent mechanisms. J. Physiol. 543, 1007-1014. Greco, S.J., Corcoran, K.E., Cho, C.J., Rameshwar, P. 2004. Tachykinins in the emerging immune system: relevance to bone marrow homeostasis and maintenance of hematopoietic stem cells. Front. Biosci. 9, 1782-1793. Gruart, V., Truong, M.J., Lumas, J., Zandecki, M., Kusnierz, J.P., Prin, L., Vinatier, D., Capron, A., Capron, M., 1992. Decreased expression of eosinophil peroxidase and major basic protein messenger RNAs during eosinophil maturation. Blood 79, 2592-2597. Ho, W.Z., Lai, J.P., Zhu, X.H., Uvaydova, M., Douglas, S.D. 1997. Human monocytes and macrophages express substance P and neurokinin-1 receptor. J. Immunol. 159, 5654-5660. Joos, G.F., Germonpré, P.R., Pauwels, R.A. 2000. Role of tachykinins in asthma. Allergy. 55, 321-337. Kang, H.S., Trzaska, K.A., Corcoran, K., Chang, V.T., Rameshwar, P., 2004. Neurokinin receptors: relevance to the emerging immune system. Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warsz) 52, 338-347. Klassert, T.E., Pinto, F., Hernández, M., Candenas, M.L., Hernández, M.C., Abreu, J., Almeida, T.A. 2008. Differential expression of neurokinin B and hemokinin-1 in human immune cells. J. Neuroimmunol. 196, 27-34. Klassert TE, Sánchez JJ, Almeida TA, Candenas L, Pinto F, Acosta O, Hernández M. 2010. Common variants of the neuropeptide expressing tachykinin genes and susceptibility to asthma: a case-control study. J Neuroimmunol. 227(1-2):202-207. Lai, J.P., Douglas, S.D., Ho, W.Z., 1998. Human lymphocytes express substance P and its receptor. J. Neuroimmunol. 86, 80-86. Maggi, C.A .1995. The mammalian tachykinin receptors. Gen. Pharmacol. 26: 911-944. Massi, M.; Panocka, I.; de Caro, G. .2000. The psychopharmacology of tachykinin NK-3 receptors in laboratory animals. Peptides 21: 1597-1609. Nénan, S., Germain, N., Lagente, V., Emonds-Alt, X., Advenier, C., Boichot, E. 2001. Inhibition of inflammatory cell recruitment by the tachykinin NK(3)-receptor antagonist, SR 142801, in a murine model of asthma. Eur. J. Pharmacol. 421, 201-205. O'Connor, T.M., O'Connell, J., O'Brien, D.I., Goode, T., Bredin, C.P. & Sanan F. 2004. The role of substance P in inflammatory disease. Journal of Cellular Phisiology. Vol. 201, pp. 167-180. Page, N.M., 2004. Hemokinins and endokinins. Cell Mol. Life Sci. 61, 1652-1663. Page, N.M., Bell, N.J., Gardiner, S.M., Manyonda, I.T., Brayley, K.J., Strange, P.G., Lowry, P.J., 2003. Characterization of the endokinins: Human tachykinins with cardiovascular activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 100, 6245-6250. Patacchini, R. & Maggi, C.A. 2001. Peripheral tachykinin receptors as targets for new drugs. Europ. J. Pharmacol. 429: 13-21. Pinto, F.M.; Almeida, T.A.; Hernández, M.; Devillier, P.; Advenier, C.; Candenas M.L. 2004. mRNA expression of tachykinins and tachykinins receptors in different human tissues. Europ. J. Pharmacol. 494: 233-239. Schuiling, M., Zuidhof, A.B., Zaagsma, J., Meurs, H. 1999. Involvement of tachykinin NK1 receptor in the development of allergen-induced airway hyperreactivity and airway inflammation in conscious, unrestrained guinea pigs. Am. J. Respir. Crit. Care. Med. 159, 423-430. Shao, C., Suzuki, Y., Kamada, F., Kanno, K., Tamari, M., Hasegawa, K., Aoki, Y., Kure, S., Yang, X., Endo, H., Takayanagi, R., Nakazawa, C., Morikawa, T., Morikawa, M., Miyabayashi, S., Chiba, Y., Karahashi, M., Saito, S., Tamura, G., Shirakawa, T., Matsubara, Y. Linkage and association of childhood asthma with the chromosome 12 genes. J. Hum. Genet. 49, 115-122. Shima, Y., Teruya, K., Ohta, H. 2006. Association between intronic SNP in urate-anion exchanger gene, SLC22A12, and serum uric acid levels in Japanese. Life. Sci. 79, 2234-2237. Zhang, Y., Berger, A., Milne, C.D., Paige, C.J., 2006. Tachykinins in the immune system. Curr. Drug Targets 7, 1011-20.