Evaluación de los efectos genómicos y no-genómicos de derivados sintéticos de antiestrógenos trifeniletilénicos

Résumé

El tamoxifeno (Tx) es un modulador selectivo para receptor de estrógenos (SERM) que se introdujo en la práctica clínica como coadyuvante en el tratamiento del cáncer de mama receptor de estrógenos positivo a partir de los años setenta. Esto es debido a su capacidad para desplazar a los estrógenos de su receptor intracelular evitando la activación e iniciación de los procesos transcripcionales asociados a la proliferación celular dependiente de estrógenos. Sin embargo, los datos procedentes de ensayos clínicos han demostrado que la utilización clínica prolongada del Tx en el tratamiento conlleva la existencia de efectos adversos asociados, como el aumento de la incidencia de carcinogénesis en tejidos como el miometrio, endometrio e hígado. Estos efectos adversos han sido relacionados con la capacidad intrínseca del Tx para comportarse como un agonista estrogénico en determinados tejidos. En esta misma línea de acciones se han podido demostrar efectos beneficiosos de tipo estrogénico del Tx sobre el tejido óseo, provocando el incremento de la densidad ósea y, por tanto, reduciendo la incidencia de osteoporosis, o sobre la reducción en los niveles de colesterol y la prevención de aterosclerosis. Además, actualmente existen considerables evidencias que sugieren que algunas acciones de estas moléculas se producen de manera no-genómica y de forma rápida, incluso en tejidos carentes de receptores de estrógenos; actuando entonces como moduladores de procesos independientes del receptor de estrógenos. Parece claro que estas acciones podrían ser responsables de ciertos efectos adversos como son la aparición de cataratas, desórdenes gastrointestinales o tromboembolismo venoso entre otros, durante los tratamientos crónicos. Con el objeto de profundizar en los mecanismos responsables de tales efectos, en nuestro laboratorio hemos creado nuevos análogos del Tx basándonos en modificaciones de la cadena lateral alquilaminoetoxi. Si bien la hidroxilación en posición 4 es la clave para formar los metabolitos activos más afines por el receptor de estrógenos, 4OH-Tx y endoxifeno, responsables, en gran medida, de la actividad del tratamiento con Tx, nosotros no hemos creado derivados hidroxilados bajo la suposición de que en los ensayos in vivo, estos derivados podrían experimentar una metabolización similar a la del Tx, pudiendo resultar metabolitos hidroxilados similares; de esta manera, nos hemos centrado en los efectos que las modificaciones en la cadena lateral alquilaminoetoxi confieren a las nuevas moléculas en cuanto a su actividad estrogénica y antiestrogénica. En este sentido, los nuevos derivados de Tx evaluados para este trabajo de investigación y presentados en esta tesis doctoral consisten en dos sales catiónicas, el bromuro de N-(Butil)tamoxifeno (BBTx) y el hidrocloruro de N-desmetiltamoxifeno (NDTHCl), y un derivado fluorescente, el N-(7-nitrobenzo[c][1,2,5]oxadiazol-4-yl)desmetiltamoxifeno (FLTX1). También se evaluó la actividad de un derivado catiónico existente, el bromuro de N-(Etil)tamoxifeno (EBTx), por su relación estructural con el BBTx. Los resultados más relevantes obtenidos en el presente trabajo de investigación concluyen que: Los nuevos derivados trifeniletilénicos en forma de sales catiónicas de tamoxifeno inhiben la actividad espontánea y la contracción inducida por Ca2+ de la musculatura lisa duodenal, así como producen la caída de la tensión tónica e inhiben la respuesta contráctil inducida por Ca2+ previa despolarización en el tejido uterino y aórtico. Esta inhibición es rápida y reversible, recuperando la actividad contráctil tras retirar el derivado impermeable del medio y realizar lavados sucesivos. Existe una relación estructura-actividad, observándose una mayor capacidad inhibitoria de la actividad contráctil cuanto mayor es el tamaño molecular de la cadena lateral alquilaminoetoxi. De tal manera que se establece la siguiente secuencia en función la capacidad inhibitoria: BBTx > EBTx > NDTHCl El hecho de que el antiestrógeno esteroideo (ICI182,780) no produjera ningún cambio sustancial de la actividad contráctil, junto con la rapidez con la que los derivados catiónicos del tamoxifeno inducen la relajación de la musculatura lisa, descarta la implicación de vías genómicas clásicas y cualquier otro tipo de vías que involucren algún tipo de receptor estrogénico tanto intracelular como de membrana. La recuperación de la actividad contráctil de los tejidos relajados por los derivados catiónicos llevada a cabo por el agonista de los canales de calcio tipo-L, BAY K 8644, sugiere un mecanismo de membrana que implica la inhibición de dichos canales en las células de músculo liso. El nuevo derivado fluorescente de tamoxifeno, FLTX1, es un compuesto estable que puede ser usado en ensayos de fluorescencia para el estudio de dianas moleculares del tamoxifeno. El FLTX1 muestra marcaje fluorescente tanto en el citosol como en la membrana plasmática de varias líneas celulares; particularmente, en la línea celular derivada de carcinoma humano MCF7, en la cual se realizaron la mayoría de los ensayos. El tamoxifeno fue capaz de reducir e inhibir por completo la señal fluorescente del FLTX1, indicando que los lugares de unión son específicos para compuestos trifeniletilénicos. Los ensayos de competición de fluorescencia con estradiol y los ensayos de unión competitiva con estradiol tritiado, demuestran que el FLTX1 se une al receptor de estrógenos con afinidad similar, o incluso algo superior, a la del tamoxifeno. Las observaciones que indican que el FLTX1 se une al receptor de estrógenos, el hecho de que sea capaz de antagonizar la expresión de luciferasa mediada por elementos de respuesta a estrógenos, y que antagonice el efecto uterotrófico de los estrógenos, apoyan consistentemente el hecho de que este derivado ejerza acciones mediadas a través de receptor de estrógenos. El FLTX1 mantiene la potencia antiestrogénica del tamoxifeno en relación a la proliferación inducida por estrógenos en las líneas celulares de carcinoma humano, y lo que es más importante, carece de la actividad agonista que sí posee el tamoxifeno tanto in vitro como in vivo, siendo esto de particular relevancia en el tejido uterino. En concordancia con otros trabajos, concluimos que la carga catiónica de la cadena lateral alquilaminoetoxi de los derivados salinos no impide la interacción con el receptor de estrógenos, ni modifica sustancialmente la afinidad de la molécula. Los resultados obtenidos en los ensayos de actividad transcripcional demuestran que estos derivados catiónicos son capaces de actuar como SERMs, siendo capaces de atravesar la membrana celular e interactuar con dianas intracelulares. Además, estos efectos transcripcionales ocurren en un periodo de tiempo no superior a las 24 horas, siendo éste claramente inferior al descrito por otros autores. La actividad moduladora también se pone de manifiesto en el efecto antiproliferativo ejercido por el NDTHCl en la línea celular MCF7, en cuanto a que es revertido por la acción de los estrógenos. Sin embargo, este hecho no se reproduce, o se reproduce parcialmente, solo a dosis bajas, en el caso del EBTx y BBTx, sugiriendo que ejercen un potente efecto citotóxico independiente de la interacción con el receptor. Bajo la premisa de que el NDTHCl se encuentra desprotonado en forma de N-desmetiltamoxifeno (NDTx) en solución a pH fisiológico, los resultados, y en particular los obtenidos in vitro, muestran que ambas sustancias, ensayadas por separado, ejercen actividades diferentes, lo que sugiere una cierta estabilidad de la estructura del hidrocloruro en su forma de sal cuaternaria. Los resultados obtenidos para el NDTHCl destacan por su actividad antiestrogénica, siendo capaz de antagonizar la activación del receptor de estrógenos y la actividad transcripcional inducida por estrógenos, lo que se traduce en su carácter antiproliferativo in vitro e in vivo. Esto, unido a su menor efecto estrogénico, nos hacen plantearlo como un posible fármaco para el tratamiento del cáncer de mama positivo para receptor de estrógenos que presenta cierta ventaja en relación al uso del tamoxifeno.