Caracterización de los enzimas implicados en la regulación de la función señalizadora de los diadenosina polifosfatos

Resumen

Los objetivos de esta tesis son: 1,- Caracterización y purificación de enzimas que degradan diadenosina polifosfatos intracelularmente (Ap3Aasa y Ap4Aasa) y de ectoenzimas que los degradan extracelularmente. 2,- Comparación de Actividad Ap3Aasa citosólica humana con la proteína supresora de tumores Fhit. Para garantizar una caracterización exhaustiva de los enzimas investigados se utilizaron una amplia gama de técnicas: cromatografía convencional y HPLC, electroforesis, ensayos de fluorescencia, ensayos enzimáticos, y diversos modelos experimentales: citosol de tejidos de rata, membranas de cerebro, cerebelo y sinaptosomas de rata, ovocitos de Xenopus laevis y citosol de leucocitos y plaquetas humanos. Estos diferentes modelos permitieron la comparación de las características de los enzimas estudiados en diferentes organismos y sistemas. Los ensayos de la actividad enzimática se realizaron con eteno derivados de diadenosona polifosfatos como sustratos fluorogénicos. Ello supone una gran simplificación sobre técnicas radiométricas y cromatográficas anteriormente en uso, y posibilita la valoración de la actividad Ap3Aasa en clínica mediante un sencillo, económico y rápido método fluorimétrico. Los resultados indican que es imposible distinguer cinéticamente entre la Actividad Ap3Aasa citosólica de plaquetas y leucocitos y la actividad Ap3Aasa de Fhit, que la suramina es el inhibidor más potente descrito hasta el momento de la actividad Ap3Aasa y que el enzima Ap3Aasa presenta un masa molecular de 32 kDa en condiciones nativas y de 17 kDa en SDS-PAGE. Se trata de la primera caracterización del enzima Ap3A hidrolasa humano. El estudio comparativo entre el enzima Ap3A hidrolasa y el supresor tumoral Fhit ha revelado que ambas proteínas son idénticas o isoformas estrechamente relacionadas. Por primera vez se atribuye una función específica al enzima Ap3A hidrolasa a pesar del tiempo transcurrido desde