Identificación de elementos reguladores en cis de la expresión del gen hxk2 de saccharomyces cerevisiae

Resumen

EL OBJETIVO DE LA PRESENTE TESIS CONSISTIO EN ESTUDIAR SECUENCIAS REGULADORAS DENTRO DE LA SECUENCIA CODIFICADORA DEL GEN HXK2 Y DE SU PROMOTOR. SE LOCALIZARON E IDENTIFICARON SECUENCIAS REGULADORAS A PARTIR DE LOS RESULTADOS OBTENIDOS POR MARTINEZ (1994) QUE OBTUVO FUSIONES EN PLASMIDOS YIP356 DIVERSOS FRAGMENTOS DEL PROMOTOR Y GEN ESTRUCTURAL. LA EXPRESION DE LA BETA GALACTOSIDASA EN LOS GENES DE FUSION MOSTRO QUE SOLAMENTE LA FUSION QUE TIENE 404 PB. DE LA SECUENCIA CODIFICADORA PRESENTA ACTIVIDAD EN GLUCOSA Y NIVELES BASALES EN ETANOL, ES DECIR LA SINTESIS DE LA PROTEINA RESPONDE A LA MISMA REGULACION QUE LA HEXOQUINASA 2 (HERRERO Y COL, 1995). LA EXPRESION EN AQUELLAS CONSTRUCCIONES QUE LLEVAN 39 PB. DE LA SECUENCIA CODIFICADORA INCLUIDAS EN LA FUSION, ES MUCHO MAYOR EN ETANOL QUE EN GLUCOSA. ESTOS RESULTADOS SUGIRIERON QUE ERA NECESARIA LA EXISTENCIA DE SECUENCIAS REGULADORAS POSTERIORES PARA QUE TENGA LUGAR LA TRANSCRIPCION CORRECTA DEL GEN. EL ESTUDIO DEL FRAGMENTO +40 +404 DE LA SECUENCIA CODIFICADORA DE HXK2 SE INICIO SUBCLONANDOLO EN EL VECTOR MULTICOPIA PUC19. UNA VEZ AMPLIADO EL FRAGMENTO Y MARCADO CON (ALFA 32P) DCTP SE REALIZARON EXPERIMENTOS DE MOVILIDAD ELECTROFORETICA. PARA LOCALIZAR E IDENTIFICAR EL O LOS SITIOS DE UNION DE PROTEINAS REGULADORAS EN ESTE FRAGMENTO SE REALIZARON DELECIONES DE 5' A 3' EMPLEANDO EXONUCLEASA III. PARA ESTUDIAR LAS DELECIONES OBTENIDAS SE CONSTRUYO EL VECTOR PNI9 A PARTIR DEL PNG22 QUE CONTIENE EL GEN DE LA BETA GLACTOSIDASA BAJO EL CONTROL DEL PROMOTOR CYC1. LA EXPRESION DE BETA GALACTOSIDASA DE LAS CEPAS TRANSFORMADAS CON LAS DELECIONES EN CONDICIONES DE DEREPRESION DEMOSTRO QUE EXISTEN 2 ELEMENTOS DENTRO DE LA REGION CODIFICADORA DEL GEN HXK2. SE ACOTO EL PRIMERO DE ELLOS ENTRE +136 Y +193, Y EL SEGUNDO ENTRE +220 Y +263. PARA IDENTIFICAR LOS SITIOS DE UNION DE ESTAS PROTEINAS SE REALIZARON ENSAYOS DE "FOOTPRINTING" IN VITRO, LOS RESULTADOS DE ESTOS IDENTIFICARON 2 ELEMENTOS REPRES