Estudio de las alteraciones del metabolismo mineral y de los trastornos óseos asociados a la enfermedad renal crónica

Resumen

1. Introducción o motivación de la tesis La enfermedad renal crónica (ERC) tiene una importante prevalencia en Europa, que varía desde el 3,3% en Noruega hasta el 17,3% en el noreste de Alemania1. Según un estudio realizado en 2010, la prevalencia de la ERC en España es del 9,1% de la población general2. Las enfermedades cardiovasculares son bastante frecuentes en el contexto de la ERC3, principalmente debido a los trastornos minerales asociados a la misma que implican un desequilibrio mineral y afecta a distintos órganos. Recientemente se está atribuyendo una importancia clave a los cambios óseos asociados a la ERC y al papel endocrino que tiene el hueso en el contexto urémico4,5. El hueso es el órgano responsable de la producción del Factor de Crecimiento Fibroblástico 23 (abreviado del inglés, FGF23) que actúa en el riñón promoviendo la excreción de fósforo y la disminución de la síntesis de calcitriol6. Los niveles de FGF23 alcanzan valores excesivamente altos en pacientes con ERC avanzada y se ha documentado que altos niveles de FGF23 producen hipertrofia de ventrículo izquierdo, insuficiencia cardiaca7,8 y favorecen el desarrollo de calcificaciones vasculares9 lo cual se ha asociado significativamente con un incremento de la mortalidad. En las fases finales de la ERC los niveles de fósforo en sangre también alcanzan valores muy elevados promoviendo el desarrollo de calcificaciones vasculares y un aumento de la mortalidad10,11. El hueso por tanto, es un órgano altamente afectado por los trastornos minerales de la ERC12–15 donde los altos niveles de hormona paratiroidea (PTH) a causa del desarrollo de un hiperparatiroidismo secundario son protagonistas de los cambios sobre la homeostasis ósea 16,17. Es importante resaltar que el hueso, además de su papel como reservorio de minerales y protección de órganos, tiene funciones críticas en otros procesos fisiológicos como la respuesta inmune18, el metabolismo de la glucosa19, interacción con hormonas sexuales20,21 y el funcionamiento del sistema nervioso central22,23 entre otros. Además, ha sido establecida una asociación entre los trastornos óseos y la mortalidad tanto en la población general24–26 como en pacientes con ERC27–29. Para disminuir la PTH, comúnmente son usados en la clínica fármacos que actúan como moduladores alostéricos positivos del receptor del calcio, también llamados calcimiméticos30,31. También el suplemento con calcitriol es usado para aumentar el calcio en plasma y favorecer la formación de hueso. Además, los quelantes de fósforo son también administrados comúnmente para disminuir la absorción de fósforo en el intestino. Entre los diferentes tipos de quelantes de fósforo, los que están basados en magnesio ofrecen beneficios adicionales, disminuyendo la calcificación inducida por alto fósforo en células de músculo liso vascular 32,33. Además, valores de magnesio bajos se relacionan con mayor mortalidad en pacientes en hemodialisis34. Hoy día, no disponemos de estudios que respondan a la pregunta de cuál es el efecto directo que tienen las alteraciones del metabolismo mineral sobre el hueso. Ya que el hueso juega un papel crítico en la patogénesis de la enfermedad renal crónica, esta tesis se basa en el estudio de los efectos de elementos como calcitriol, magnesio, FGF23 o calcimimético sobre la homeostasis del hueso en condiciones de uremia. 2. Contenido de la investigación La presente tesis doctoral comprende cuatro estudios distintos centrados en la valoración in vivo e in vitro de los cambios óseos inducidos por Magnesio, calcitriol, calcimimético y FGF23. Los efectos in vivo sobre el hueso han sido estudiados utilizando un modelo animal de insuficiencia renal en rata (nefrectomía 5/6, salvo para FGF23 que se usó un modelo de heminefrectomía) mientras que los estudios in vitro se han dirigido a evaluar el efecto de cada uno de los elementos estudiados sobre la diferenciación de células madre progenitoras hacia osteoblastos y osteoclastos. A continuación se desglosa cada estudio por separado. El suplemento de magnesio en la dieta (0,3 y 0,6%) provocó una disminución de la concentración plasmática de PTH en ratas con insuficiencia renal. A pesar de esta disminución, mantuvo la actividad osteoblástica en el hueso, mientras que redujo la actividad osteoclástica, indicando que el magnesio tiene actividad sobre las células de hueso. In vitro, los efectos directos del suplemento de magnesio sobre la diferenciación de células madre mesenquimales fueron estudiados, y observamos que el tratamiento con magnesio incrementó la expresión de genes osteogénicos y la mineralización mediante una activación de la ruta Notch, mientras que la inhibición del canal de magnesio TRPM7 la disminuyó observándose los efectos contrarios. Por otro lado, también estudiamos el efecto del suplemento de magnesio sobre la diferenciación de osteoclastos a partir de células progenitoras hematopoyéticas, no encontrando efectos significativos sobre este proceso. Estos resultados han sido publicados en dos artículos35,36. Para realizar el estudio del efecto del calcimimético (activador del receptor de Calcio) sobre el hueso, desarrollamos un modelo animal para separar los efectos del calcimimético sobre la bajada de PTH de los posibles efectos directos de éste sobre el hueso. Para ello, en un modelo de rata con nefrectomía 5/6, realizamos una paratiroidectomía total y colocamos una bomba subcutánea que realizaba una infusión constante de PTH recombinante de rata para mantener los niveles de calcio y fósforo. En este modelo encontramos que el tratamiento con calcimimético mantuvo el remodelado óseo a pesar de disminuir considerablemente la PTH. Además, mediante estudios in vitro usando células UMR-106, una línea celular de osteoblastos de rata, y células mesenquimales de médula ósea de humano diferenciadas a osteoblastos, demostramos que el tratamiento con calcimimético incrementó tanto la expresión de genes osteogénicos como la mineralización. Estos efectos estaban asociados a un incremento de la fosforilación de ERK1/2. Además, el tratamiento de estas células con un modulador alostérico negativo del receptor de calcio produjo los efectos contrarios. Finalmente, observamos que el calcimimético tiene un efecto activador sobre la osteoclastogénesis in vitro. Los resultados derivados de estos estudios han sido recientemente aceptados para publicación en la revista Kidney International37. El estudio del efecto del calcitriol sobre el hueso fue realizado en un modelo animal similar al anterior, ratas con nefrectomía 5/6, paratiroidectomizadas y con reemplazamiento de PTH para mantener los niveles de fósforo y de calcio, a las que se administró calcitriol a las dosis de 20, 40 y 60 ng/kg de peso corporal. Encontramos que a las dosis de 20 y 40 ng/kg el calcitriol disminuyó la actividad osteoblástica en el hueso, mientras que a la dosis de 60 ng/kg (que es una dosis elevada), produjo hiperfosfatemia e hipercalcemia y un incremento de la actividad osteoblástica en el hueso, que además presentaba signos de mineralización defectuosa. In vitro, el tratamiento con calcitriol a dosis fisiológicas promovió el incremento de la expresión de genes osteogénicos y la mineralización, mientras que dosis suprafisiológicas disminuyeron tanto la mineralización como la osteogénesis mediante una inhibición de la ruta Wnt/β-catenina, que tiene una importante implicación en la formación de hueso. Además, observamos que el calcitriol incrementó la osteoclástogenesis in vitro. El estudio del papel del FGF23 sobre el hueso fue realizado en un modelo de enfermedad renal temprana en rata, donde no hay cambios significativos en otros parámetros de metabolismo mineral. Para ello, se redujo la masa renal de las ratas en un 50% mediante heminefrectomía (Nx1/2) y se alimentaron con una dieta con alto contenido en fósforo. Comparadas con ratas con función renal normal, a las cuales se practicó una cirugía simulada (Sham), alimentadas con la misma dieta, las ratas Nx1/2 presentaron niveles ligeramente más elevados de creatinina en plasma y más alto FGF23, mientras que los valores de calcio, fósforo, PTH y calcitriol en plasma fueron similares. En las ratas Nx1/2, que tenían más altos niveles de FGF23 intacto en plasma, observamos una tendencia a bajar del volumen óseo trabecular y un incremento del remodelado, además el hueso presentaba una disminución de la expresión de genes osteogénicos y un incremento en los niveles plasmáticos de esclerostina, un inhibidor de la ruta Wnt/β-catenina. In vitro, el tratamiento con concentraciones elevadas de FGF23 disminuyó la expresión de los genes osteogénicos a distintos estadios de diferenciación y esta disminución estuvo asociada a una inhibición de la ruta Wnt/β-catenina. También in vitro, concentraciones elevadas de FGF23 produjeron un incremento de la diferenciación de osteoclastos, así como un incremento del tamaño. Todos estos resultados indican un efecto directo de estos elementos sobre el hueso que contribuyen a las complicaciones en la ERC. 3. Conclusiones 1. En un modelo de insuficiencia renal en rata, la administración de calcitriol a dosis que no promueven ni hiperfosfatemia ni hipercalcemia, reduce el tiempo de mineralización y la actividad osteoblástica de manera PTH-independiente. 2. In vitro, el tratamiento con calcitriol inhibe la diferenciación osteogénica y la mineralización y promueve la diferenciación de células progenitoras hematopoyéticas hacia osteoclastos. 3. En un modelo murino de insuficiencia renal, el tratamiento con calcimimético mantiene el remodelado óseo a pesar de la consecuente disminución de los niveles de PTH. 4. La modulación del receptor de calcio mediante calcimimético y calcilítico regula la diferenciación osteogénica y la mineralización y el calcimimético podría promover la diferenciación osteoclástica. 5. En un modelo de calcificación vascular en rata, el suplemento de magnesio en la dieta mantiene la actividad osteoblástica en el hueso y reduce la actividad osteoclástica a pesar de disminuir la concentración de PTH en plasma, sin embargo altas dosis de magnesio podrían producir defectos de mineralización ósea. 6. In vitro, el suplemento de magnesio promueve la diferenciación osteogénica y la mineralización y no afecta significativamente a la diferenciación de células progenitoras hematopoyéticas a osteoclastos. 7. El incremento de FGF23 está asociado con un incremento del remodelado óseo y con cambios en la microestructura trabecular ósea en un modelo de enfermedad renal temprana. 8. Concentraciones altas de FGF23 disminuyen la diferenciación osteogénica mediante la inhibición de la ruta Wnt/β-catenina y aumenta la diferenciación osteoclástica. 1. Introduction In Europe, Chronic Kidney Disease (CKD) has an estimated prevalence ranged from 3.3% in Norway to 17.3% in Northeast Germany1. In Spain, the EPIRCE study reported an overall prevalence of CKD of 9.09%2. In CKD, cardiovascular diseases are common3, mainly due to mineral metabolism disorders associated with CKD that affect several organs. Recently, the potential implication of bone abnormalities associated with CKD and the role of bone as an endocrine organ are being considered in the uremic context4,5. Bone is the organ responsible for Fibroblast Growth Factor 23 (FGF23) production, which acts in the kidneys and promotes phosphate excretion and calcitriol synthesis inhibition6. FGF23 levels reach extremely high concentrations in end stage CKD patients and it has been reported that high FGF23 plasma levels induce left ventricular hypertrophy and heart failure7,8 and exacerbate the development of vascular calcification9, which is associated with a significant increase in overall and cardiovascular mortality. In end stage of renal disease, plasma phosphate levels also become abnormally elevated, promoting the development of vascular calcification and an increasing mortality10,11. In this respect, bone is an organ highly affected due to mineral metabolism disorders associated with CKD12–15. Additionally, high parathyroid hormone (PTH) levels, due to the development of secondary hyperparathyroidism, play an important role on bone homeostasis16,17. It is important to note that, despite its role as a mineral store and organ protection, bone has critical functions on other physiological processes such as immune response18, glucose metabolism19, sexual steroid interaction20,21 and brain function22,23 among others. Furthermore, it has been established an association between bone disorders and mortality in the general population 24–26 and in CKD patients27–29. To manage PTH levels, there exist pharmacological drugs commonly used in clinical practice that act as allosteric modulators of the calcium sensing receptor, called calcimimetics30,31. In addition, calcitriol supplement is used to increase plasma calcium and bone formation. Moreover, phosphate binders are also commonly used to decrease intestinal phosphate absorption. In this respect, magnesium-based phosphate binders have additional benefits, decreasing the development of phosphate-induced vascular smooth muscle cells calcification32,33. Furthermore, low plasma magnesium concentration is associated with increased mortality in hemodialysis patients34. Nowadays, few studies have been carried out to address the implication of the mineral metabolism alterations on bone. Considering that bone plays a critical role in the pathogenesis of CKD, this thesis is based on the study of the effects of elements such as calcitriol, magnesium, FGF23 or calcimimetic on bone homeostasis in uremic conditions. 2. Research content This PhD thesis comprises four studies focused on the examination of the in vitro and in vivo bone effects induced by magnesium, calcitriol, calcimimetic and FGF23. The in vivo bone effects have been evaluated by using an animal model of renal insufficiency in rat (5/6 nephrectomy, except for the studies with FGF23, in which a model of early renal disease, heminephrectomy, was used). For in vitro studies, the effects of each treatment on the differentiation of the corresponding progenitor cells into osteoblasts and osteoclasts were evaluated. Following the results for every study are detailed separately. Dietary magnesium supplementation (0.3 and 0.6%) produced a decrease in PTH plasma concentration in rats with renal insufficiency. Despite the reduction in plasma PTH levels, magnesium supplementation maintained osteoblast activity in bone, while it decreased osteoclastic activity, indicating that dietary magnesium supplementation may exert actions on bone cells. In vitro, the direct effects of magnesium supplementation on the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells were studied, and we observed that magnesium treatment increased osteogenic gene expression and mineralization by activation of the Notch signaling pathway, whereas the inhibition of the magnesium channel TRPM7 produced the contrary effects. On the other hand, we also studied the effects of the magnesium supplementation on the differentiation of hematopoietic progenitor cells into osteoclasts, and we do not observed significant effects on this process. These results have been reported in two articles35,36. To carry out the in vivo study of the effects of calcimimetic (calcium sensing receptor activator) on bone, we performed an animal model to separate the effects of the calcimimetic on the reduction of PTH secretion from those triggered on bone. To address this proposal, we used a rat model of 5/6 nephrectomy, with total parathyroidectomy and subsequently received a constant infusion of rat recombinant PTH to maintain calcium and phosphate levels. In this model, we found that calcimimetic treatment maintained bone turnover despite the decrease of PTH levels. Moreover, in vitro studies using UMR 106 cells, an osteoblastic cell line, and human bone marrow mesenchymal stem cells differentiated into osteoblasts, we demonstrated that calcimimetic treatment increased osteogenic gene expression and mineralization. These effects were associated with increased ERK1/2 phosphorylation. In addition, treatment with a negative allosteric modulator of the calcium sensing receptor produced the contrary effects. Finally, we observed that the calcimimetic exert positive effects on the activation of osteoclastic differentiation in vitro. Results from these studies have been recently accepted for publication in the journal Kidney International37. To evaluate the effects of calcitriol on bone we performed an animal model similar to that mentioned above. 5/6 nephrectomized and parathyroidectomized rats with constant PTH infusion to maintain calcium and phosphate levels, were treated with calcitriol at 20, 40 and 60 ng/kg of total body weight. We found that calcitriol at 20 and 40 ng/kg decreased the osteoblastic activity, while calcitriol at 60 ng/kg (high dose) produced hyperphosphatemia and hypercalcemia, increases osteoblastic activity and induced defective bone mineralization. In vitro, calcitriol treatment at physiological doses increased osteogenic gene expression and mineralization, whereas supraphysiological doses decreased both, osteogenesis and mineralization through inhibition of the Wnt/β-catenin pathway, which has an important role in bone formation. Furthermore, we observed that calcitriol also increased the osteoclastogenesis in vitro. To study the role of FGF23 on bone, we performed an animal model of early renal disease, which do not show significant changes in the other plasma mineral parameters. In this way, renal function was reduced by 50% by unilateral total nephrectomy (1/2Nx) and rats were fed on a high phosphate diet. As compared with rats with normal renal function, in which simulated surgery was performed (Sham), and fed on the same diet, 1/2Nx rats showed slight but significantly higher plasma creatinine levels and higher plasma intact FGF23, whereas plasma calcium, phosphate, PTH and calcitriol remained similar in both groups. In 1/2Nx rats, which had higher plasma FGF23, we observed a tendency to decrease trabecular bone volume and increased bone turnover. Moreover, osteogenic gene expression was reduced in bone and plasma sclerostin levels, a well-known Wnt/β-catenin inhibitor, were increased in 1/2Nx as compared with Sham rats. In vitro, treatment with rat recombinant intact FGF23 at high doses decreased the osteogenic gene expression at different stages of osteogenic differentiation in rat bone marrow mesenchymal stem cells and this decrease was associated with an inhibition of the Wnt/β-catenin pathway. Also in vitro, high concentrations of intact FGF23 produced an increase in osteoclastic differentiation of hematopoietic progenitor cells and also increased osteoclast enlargement. Altogether, our results demonstrate a direct effect of these compounds on bone that contribute to the CKD complications 3. Conclusions 1. In a rat model of renal insufficiency, calcitriol administration at doses that do not promote hyperphosphatemia and hypercalcemia reduces the time of mineralization and osteoblast activity in a PTH-independent manner. 2. In vitro, calcitriol inhibits osteoblast differentiation and mineralization and promotes osteoclast differentiation. 3. In a murine model of renal insufficiency, treatment with calcimimetic maintains bone turnover despite the concomitant decrease in parathyroid hormone levels. 4. Calcium sensing receptor modulation by calcimimetic and calcilytic regulates osteoblast differentiation and mineralization and calcimimetic may promote osteoclast differentiation. 5. In a rat model of vascular calcification, dietary magnesium supplementation maintains osteoblast activity in bone and reduces the osteoclast activity in spite of the decrease in plasma parathyroid hormone concentration, however at high doses might promote defective mineralization. 6. In vitro, magnesium supplementation promotes osteoblast differentiation and mineralization and do not significantly affects osteoclast differentiation. 7. The increase in plasma FGF23 is associated with increased bone turnover and changes in trabecular bone microstructure in a murine model of early CKD. 8. High FGF23 concentration decreases osteogenic differentiation by inhibition of the Wnt/β-catenin pathway and increases osteoclast differentiation. 4. Bibliografía/References 1. Brück K, Stel VS, Gambaro G, et al. 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