Investigación de las bases inmunológicas implicadas en la enfermedad de chagas provocadas por el protozoo parásito trypanosoma cruzi

  1. Elena Pérez Antón
Supervised by:
  1. Manuel Carlos López López Director

Defence university: Universidad de Granada

Year of defence: 2019

Committee:
  1. Mario Delgado Mora Chair
  2. María del Carmen Ruiz Ruiz Secretary
  3. Emma Carmelo Pascual Committee member
  4. Agustín Benito Llanes Committee member
  5. Basilio Valladares Hernández Committee member

Type: Thesis

Teseo: 596156 DIALNET

Abstract

El parásito protozoario Trypanosoma cruzi es el agente causal de la Enfermedad de Chagas. Esta dolencia es considerada una de las enfermedades tropicales desatendidas más prevalentes. Recientemente la Organización Mundial de la Salud (OMS) ha establecido el 14 de abril como el día mundial del Chagas, requiriendo a estados e instituciones todo el esfuerzo que sea necesario para su control. Esta enfermedad, afecta esencialmente a la población de América Latina, donde la transmisión vectorial es endémica y donde provoca el mayor desgaste social y económico. Se estima que en torno a 10 millones de personas se encuentran infectadas por dicho parásito y causa la muerte de aproximadamente 10.000 personas al año. Fue descrita hace más de 100 años y aún hoy representa un grave problema de salud mundial. La infección por el parásito, en ausencia de tratamiento, pasa rápidamente de una fase aguda, con alta presencia del parásito en sangre, a una fase crónica, en la cual el parásito reduce su carga en sangre infectando otros tejidos. La gran mayoría de los pacientes presentan una fase crónica sin sintomatología perceptible. Sin embargo, por mecanismos no totalmente esclarecidos, una fracción importante de los pacientes, de en torno al 40%, pasa a cursar una fase crónica sintomática asociada principalmente con alteraciones cardiacas que puede desencadenar en la muerte del afectado. Por su lado, el sistema inmunitario del hospedador se activa para controlar la infección desencadenándose diversos mecanismos de respuesta innata y adaptativa, en un frágil balance entre el control parasitario y la homeostasis inmune. Debido a la condición esencialmente intracelular del parásito, las poblaciones linfocitarias T, capaces de desarrollar una respuesta antígeno-específica, juegan un papel crítico para el control de la infección. Las células T CD8+ se caracterizan por desencadenar mecanismos citotóxicos frente a células infectadas por el parásito, siendo su presencia fundamental para no sucumbir a la infección. De igual manera, el carácter imprescindible de la población de células T CD4+ para la resistencia a la enfermedad se ha demostrado de manera sólida. Esta población T se caracteriza principalmente por facilitar la acción de las células T citotóxicas a través de señales mediadas por contacto célula a célula; así como por ser las principales productoras de citoquinas de tipo Th1, como IFN-γ, que activan la respuesta inmunitaria antiparasitaria a diferentes niveles celulares. A su vez, se conoce la presencia de una población T CD4+CD8+ que aumenta su frecuencia durante la infección crónica por T. cruzi, pero se desconoce en profundidad el impacto que presenta para el control de la infección. Es conocido que, las poblaciones linfocitarias T, durante infecciones crónicas virales y parasitarias sufren un proceso de agotamiento que reduce su capacidad funcional. Este proceso en la enfermedad de Chagas ha sido parcialmente descrito en la población de células T CD8+, el cual además parece potenciarse con el transcurso de la patología. Por su parte, el tratamiento vigente para esta enfermedad, basado principalmente en la quimioterapia con benznidazol, se centra en la eliminación de la carga parasitaria en sangre, siendo más eficaz cuanto antes se administra tras la infección por el parásito. Su eficacia durante la fase crónica en adultos se encuentra en un persistente debate científico. Ensayos clínicos ponen en entredicho el tratamiento hacia estos pacientes, por la escasa remisión observada de los síntomas clínicos. Sin embargo, se ha demostrado que el tratamiento antiparasitario disminuye la carga de parásitos en sangre, reduce el desarrollo de alteraciones cardiacas en pacientes crónicos asintomáticos, y podría conducir a una mejora en la respuesta inmune contra el parásito T. cruzi causante de la patología chagásica. Debido a estos hechos, la OMS y ciertas revisiones sistemáticas recomiendan el uso de los tratamientos tripanocidas en pacientes con infección crónica. Pero es evidente la necesidad de terapias complementarias que tengan como foco la completa cura del paciente. Igualmente, las herramientas que evalúan la eficacia del tratamiento antiparasitario en pacientes con infección crónica son insuficientes. La serología convencional permanece reactiva en la gran mayoría de los pacientes, aún muchos años después de finalizar el tratamiento, no siendo resolutiva a corto-medio plazo. Por su parte, el seguimiento por PCR se dificulta, por la baja parasitemia en sangre y la alta probabilidad de falsos negativos. Sin embargo, recientemente se han identificado y descrito diversas moléculas antigénicas del parásito de potencial uso como herramientas de evaluación, a corto-medio plazo, de la eficacia del fármaco en pacientes crónicos de Chagas. Entre ellas, se encuentra el set “Chagnostik” desarrollado en el laboratorio donde se ha realizado la presente Tesis doctoral. Dicha prueba evalúa la reactividad del paciente frente a cuatro moléculas específicas del parásito en el trascurso del seguimiento del paciente tratado, logrando discernir entre pacientes con fallo o éxito terapéutico. Sobre la base de todo lo anteriormente enunciado, se planteó como uno de los objetivos de trabajo experimental de la presente Tesis doctoral, evaluar la funcionalidad y el fenotipo de las células T CD4+CD8+ en el transcurso de la infección crónica por T. cruzi y estudiar si la población T CD4+CD8+ sufre un proceso de agotamiento, similar al descrito previamente en el laboratorio para las células T CD8+, que afecte a su capacidad funcional y cómo este se desarrolla en el trascurso de la patología. Los resultados obtenidos mostraron la capacidad de desarrollar una repuesta multifuncional frente a antígenos específicos del parásito por parte de las células T CD4+CD8+, lo que confiere a esta población un posible papel fundamental para el control de la enfermedad. A su vez, descubrimos que existe un fenotipo diferencial de células T CD4+CD8+ entre pacientes asintomáticos y aquellos con alteraciones cardiacas, encontrando un mayor proporción de células T CD4+CD8high, las cuales se asocian con una subpoblación de fenotipo activo, en pacientes asintomáticos; y contrariamente una mayor proporción de células T CD4+CD8low en pacientes con alteraciones cardiacas, subpoblación que se asocia con origen celular senescente. Se observó, además, que esta población T CD4+CD8+ sufre un proceso de agotamiento en pacientes en fase crónica, ya que sus células presentan una aumentada expresión y co-expresión de moléculas inhibitorias en sus membranas. Otro de los principales objetivos de la presente Tesis fue evaluar si estas modificaciones funcionales, observadas en la subpoblación de células dobles positivas (CD4+CD8+), ocurrían en la población de células T CD4+. Los resultados obtenidos, mostraron que en la población de células T CD4+ también se produce un proceso de agotamiento durante la infección crónica por T. cruzi, dándose de forma más drástica en pacientes sintomáticos que en asintomáticos. Así, los pacientes con enfermedad de Chagas que presentan alteraciones cardiacas mostraron una expresión y co-expresión de receptores inhibitorios en membrana altamente superior, lo que a su vez repercute en una menor capacidad multifuncional antígeno-específica de dichas células T CD4+. Los pacientes indeterminados mostraron un proceso de agotamiento menos acusado, el cual permite una mayor capacidad multifuncional de sus células T CD4+. Los datos de agotamiento de las poblaciones T, CD4+, CD4+CD8+ unido a aquellos previamente descritos para las células T CD8+, nos inducen a pensar que este proceso pudiera estar impidiendo el total aclaramiento de la infección. Por otra parte, se proyectó estudiar el impacto del tratamiento con benznidazol en el proceso de agotamiento celular de las principales poblaciones linfocitarias T (CD8+, CD4+ y CD4+CD8+); y analizar la funcionalidad de las células T CD8+ antígeno-especificas en pacientes con éxito versus fracaso terapéutico en base al mencionado set de biomarcadores séricos “Chagnostik”. Así, la evaluación de la capacidad funcional y del fenotipo de las distintas subpoblaciones de células T en pacientes tratados con benznidazol mostró que el tratamiento provoca en los pacientes crónicos una reversión parcial del proceso disfuncional que sufren estas poblaciones. Los resultados obtenidos muestran una reducción de la elevada expresión y co-expresión de receptores inhibitorios encontrada previamente al tratamiento y una mejora de la capacidad multifuncional, frente antígenos específicos del parásito, de estas poblaciones celulares, aumentando su capacidad de producción y co-producción de moléculas citotóxicas y citoquinas de tipo Th1. Se observa que esta reversión del proceso de agotamiento celular ocurre de forma más notoria en pacientes indeterminados que en aquellos con una mayor severidad de la patología. Este hecho pudiera estar asociado al aumento de la irreversibilidad del proceso de agotamiento cuanto más severo es el mismo, y como sucede en pacientes sintomáticos. Asimismo, se observa tras el tratamiento una reducción de la subpoblación de células T CD4+CD8low asociada con un origen senescente, y un aumento de aquella de fenotipo activo, CD4+CD8high. El análisis comparativo de la respuesta funcional antígeno-específica de las células T CD8+, en pacientes con éxito versus fracaso terapéutico bajo los criterios del mencionado set de biomarcadores séricos, mostró una notoria mayor capacidad citotóxica de estas células tras el tratamiento en aquellos pacientes con éxito terapéutico, a diferencia de en aquellos con fracaso terapéutica. Asimismo, las células T CD8+ citotóxicas de los pacientes con éxito terapéutico, muestran previamente al tratamiento un cierto perfil funcional diferencial. De igual manera, las células de los pacientes que cumplen los criterios de éxito terapéutico muestran una aumentada capacidad multifuncional tras el tratamiento, así como, una reducción de la proporción de células monofuncionales y un notorio descenso de la expresión superficial de moléculas inhibitorias en sus células T CD8+. Sobre la base de los datos experimentales obtenidos durante el desarrollo de la presente Tesis y resumidos anteriormente, postulamos que los perfiles evaluados en las diferentes poblaciones T, y los respectivos marcadores celulares, pudieran servir como herramienta de pronóstico de la enfermedad y para la evaluación de las terapias antiparasitarias vigentes o en desarrollo. Además, estimamos que, estos resultados representan un significativo avance en el conocimiento de los mecanismos que pudiera estar influyendo en la pérdida del control de la infección parasitaria, y de la rotura del equilibrio que desencadena en el desarrollo de una sintomatología perceptible.