Utilización de la proteómica como herramienta de estudio de los mecanismos de infección y transducción de señales en el hongo fitopatógeno Botrytis cinerea

Resumen

Botrytis cinerea, el agente etiológico de la podredumbre gris, es uno de los fitopatógenos con mayor impacto agroalimentario. Debido a su elevada virulencia, versatilidad y características necrotróficas es considerado además como organismo modelo en fitopatólogía fúngica molecular. La presente tesis doctoral está enfocada al estudio global de los principales efectores de las cascadas de señalización en B. cinerea: fosfoproteínas y proteínas de membrana. Para ello en primer lugar se evaluó el efecto de distintos compuestos (Glucosa, Celulosa y pareces celulares de tomate –TCW-) como inductores de cambios en el fenotipo de B. cinerea. Los resultados obtenidos mostraron una gran influencia de los compuestos ensayados en el fenotipo del hongo a distintos niveles siendo lo mas llamativo el efecto en la producción de botridial, observándose la inhibición de la síntesis de esta toxina en presencia del elicitor vegetal TCW. Estos resultados junto con datos previos que muestran la capacidad TCW como inductor de la expresión de proteínas hidrolíticas secretadas, avalaron la capacidad de los elicitores vegetales como inductores de cambios en la síntesis de factores de patogenicidad/virulencia, quedando así justificada su utilidad en el estudio comparativo de las proteínas de membrana y proteínas fosforiladas como inductores de diferentes condiciones de patogenicidad. Dichos estudios se llevaron a cabo mediante aproximaciones proteómica tipo “shotgun” a partir de micelio de Botrytis cinerea (B.05.10) cultivado bajo diferentes condiciones de patogenicidad inducidas mediante el uso de Glucosa o TCW como únicas fuentes de carbono. El análisis proteómico del membranoma de Botrytis cinerea permitió la identificación 2794 proteínas de las que aproximadamente un 46% fueron clasificadas como proteínas de membrana en base la aplicación de diversos algoritmos de predicción topológica de regiones transmembrana y uniones covalentes. Respecto al fosfoproteoma, se identificaron un total 2883 y 1137 fosfopéptidos en presencia de glucosa y TCW que mapearon para 1338 y 733 fosfoproteínas respectivamente. Mediante el desarrollo de diversos análisis comparativos se detectaron claras diferencias en la composición y abundancia de ambos subproteomas (membranoma y fosfoproteoma) entre los distintos estados de patogenicidad inducidos. El posible impacto biológico de estas variaciones tanto cualitativas como cuantitativas se determinó mediante clasificación ontológica de las proteínas diferencialmente identificadas en cada caso. Los resultados mostraron un posible incremento en la actividad de las cascadas de señalización de Botrytis tanto a nivel de los efectores primarios (proteínas de membrana) como secundarios (fosfoproteínas) en presencia de glucosa. Por otro lado en presencia de TCW los procesos biológicos mas favorecidos parecen ser aquellos relacionados con la degradación de la pared celular y la respuesta al estrés oxidativo y el metabolismo y transporte de carbohidratos. Entre las proteínas identificadas se detectaron un total de 65 fosfoproteínas implicadas directamente en señalización celular. Análisis comparativos de estas fosfoproteínas sugieren que el uso de TCW y glucosa puede inducir modificaciones en diversas vías de señalización como la vía de respuesta a shock hiperosmótico, la vía de de las MAP-quinasas o la vía de las GTPasas. Como resultado, de todo lo expuesto esta Tesis Doctoral constituye el primera aproximación proteómica diferencial tanto al estudio del membranoma como del fosfoproteoma en Borytis cinerea.