Regulación del ciclo de las vesículas sinápticas por sinaptotagminas

Zusammenfassung

Regulación del ciclo de las vesículas sinápticas por Sinaptotagminas. En cerebro humano está formado por más de un billón de neuronas. Cada neurona hace contacto con otras formando una red neuronal que permite transmitir, procesar y generar las distintas funciones cerebrales. La sinápsis es el mecanismo clave de este proceso, esta es una zona especializada de contacto entre neuronas, donde se lleva a cabo la transmisión de la información desde la neurona presináptica (emite la información) a la neurona postsináptica (recibe la información). La transmisión sináptica es iniciada por la llegada de un potencial de acción (PA) que provoca una despolarización de la membrana, esto induce la apertura de canales de calcio voltaje dependiente, por tanto el calcio entra en el interior celular y provoca la liberación de vesículas (exocitosis). Posteriormente, las vesículas son endocitadas, recicladas y rellenadas de nuevo de neurotransmisores para una nueva ronda de exocitosis. Las Sinaptotagminas (Syt) son una familia de proteínas de membranas que funcionan como sensores de calcio regulando la fusión de membranas . Existen 17 isoformas muy conservadas evolutivamente y con una estructura en común que contiene: Un dominio N-terminal con una región transmembrana (TMR), una región ¿Linker¿ y la región de dominios C2 (C2A y C2B), es en estos dominios donde se da el carácter de sensor de calcio. Ambos dominios son capaces de captar 3 moléculas de calcio gracias a unas regiones ricas en residuos de aspartato. La sinaptotagmina 1, es la isoforma de esta familia mejor caracterizada, está presente en vesículas sinápticas y es esencial para la transmisión sináptica rápida y se ha visto que la eliminación de esta isoforma afecta a la probabilidad de liberación. La signatotagmina 7 se encuentra ubicada en la membrana plasmática de las neuronas, su afinidad por el calcio es mucho mayor que la de la sinaptotagmina 1, esta proteína parece estar implicada en exocitosis lenta y reciente estudios la asocian a la liberación asincrónica pero en la actualidad no se sabe con certeza cuál es su función en el sistema nervioso central. Las vesículas sinápticas son orgánulos abundantes y uniformemente pequeños (~40nm diámetro). A través de distintas técnicas de imagen (uso de fluorinas, colorantes FM¿) se han podido estudiar las distintas poblaciones de vesículas en las distintas sinápsis, y todas presentan principalmente 3 grupos de vesículas. Contingente de vesículas listas para ser liberadas (RRP, del ingles ready releasable pool), son aquellas vesículas lista para ser liberadas, estas vesículas se encuentran en la zona activa anclada a la membrana presináptica e interaccionando con la maquinaria de fusión y pueden ser liberadas por la aplicación de 40PA, 20Hz. Contingente de reserva (RP, reserve pool), son aquellas vesículas que no se encuentran ancladas en la zona activa pero que son liberadas en presencia de una mayor actividad. Y finalmente contingente de reposo (resting pool), estás vesículas no están ubicadas en el terminal nervioso, y no pueden ser liberadas incluso utilizando máxima estimulación. No se sabe con certeza cuál es la función de esta población de vesículas. Dado que aparentemente las vesículas que participan en la transmisión sinápticas son las que pertenecen al contingente RRP y de reserva, al conjunto de vesículas de estas dos poblaciones se les conoce como contingente de reciclaje ( y podrá ser liberado a 600PA, 20Hz . Se han utilizado cultivos de neuronas de hipocampo de ratones recién nacidos (P0 ó P1) de las ratones a los que se le ha eliminado la Synaptotagmina 7 o la Sinaptotagmina 1, crecidas sobre una monocapa de astrocitos de rata Wistar (P0 ó P1). A los 10 días de cultivo se infectaron las neuronas con Adenovirus que contienen la construcción SypHy (esta construcción posee una proteína de la membrana vesícular, la sinaptofisina, unida a GFP super eclíptica, que es dependiente del pH) esta nos permitirá estudiar la exocitosis-endocitosis, de forma que cuando la vesícula se expone al medio extracelular, pH ~7.4, se produce un incremento de la fluorescencia, en la endocitosis, la vesícula se reacidifica y por tanto hay un apagamiento de la fluorescencia. En este trabajo se ha comprobado el papel de las isoformas de Sinaptotagmina 1 y 7 en la liberación vesicular sobre los distintos contingentes de vesículas. Para ello se infectaron las neuronas de las distintas líneas comentadas anteriormente y aplicamos trenes de estímulos de una forma creciente (1-40-100-600 PA) para liberar los distintos contingentes vesiculares. A 40 PA se libera el RRP, con 100PA y 600PA se liberan el contingente de reciclaje. La presencia de bafilomicina (droga que inhibe la bomba de protones, ATPasa vesicular) permite determinar el contingente de reserva y finalmente la aplicación de NH4Cl (que alcaliniza todas las vesículas) el contingente de reposo. El análisis de la respuesta a 1PA nos permitie estudiar si las diferentes isoformas tienen algún efecto sobre el tamaño cuántico y la probabilidad de liberación.