Nitrito reductasa y glutamato sintasa de chlamydomonas reinhardtiiDominios de interaccion fd: proteina, clonación de la glutamato sintasa dependiente de ferredoxina

Resumen

En esta tesis, se ha caracterizado la interacción funcional entre la ferredoxina (Fd) y la enzimas NiR y GOGAT del alga eucariota Chalnydomonas reinhardtii, mostrando la formación de un complejo Fd;NiR de estequiometría 1:1 y de dos complejos Fd:GOGAT con este quiometría 1:1 y 2:1.Los datos obtenidos implican la existencia de un único sitio de unión a Fd en Nir mientras que GOGAT posee dos sitios de interacción a la proteína. Ademñás se ha observado que el proceso de itneracción entre Fd y GOGAT se ve favorecido en células crecidas en amonio o sometidas a carencia de nitrógeno correlacionándose conla mayor actividad de la enxima observda en cultivos bajo estas condiciones nutricionales. Se ha obtenido también, una estructura teórica de la ferredoxina de C. Reinhardtii, en la que se meustra que está formada por un cuerpo central compuesto por 5 hojas plegadas b y una hélice a. La existencia además, de dos hojas plgadas b cortas, una hélice a2, así como una vuelta hlicoidal corta (a3), en el extremo carboxi-terminal de la proteína, la hace asemejarse más da la Fd de hoa de espinaca que a la proteína de organismos procariotas. A su vez hemos trabajado con una serie de mutantes situados en las hélices a1 y a3 para determinar regiones específicas implicdas en el mecanismo de interacción con las enximas. La combinación del cálculo de potenciales superficiales sobre el modelo de estructura, así como medidas de actividad enzmática, potenciales redox y estudios de itneracción de muestran la implicación de los glutámicos 91 y 92 y de la región que comprende a los aminoácidos aspárico 25 y glutámicos 28 y 29 en la unión a las enzimas. En el desarrollo de esta tesis también se ha llevado a cabo la clonación de un cDNA parcial (CrFG-3) que codifica Fd-GOGAT de C. Reinhardtii y que se encuentra como una única copia en del genoma. CrFG-3 presenta una fse de lectura abierta de 847 aminoácidos. La comparción