Mecanismo de regulación negativa de la ruta de asimilación de nitrato en chlamydomonas reinhardtii

Resumen

Se han identificado en C.reinhardtii mediante mutagénesis insercional tres loci (Nrg1 (N1), Nrg3 (N10), Nrg4 (N24)) implicados en la ruta de señalización negativa que ejerce el amonio, y/o sus derivados, sobre la asimilación de nitrato en este alga. Los mutantes afectados en estos genes Nrg han sido seleccionados por su fenotipo de sensibilidad a clorato en presencia de amonio (CSA), condición bajo la cual la estirpe parental es resistente. El análisis genético de estos mutantes indica que las mutaciones están asociadas a la inserción plasmídica, son epistáticas sobre el alelo mutante nit2, y afectan a genes que no se encuentran ligados entre sí. Las mutaciones Nrg de las estirpes N1, N10 y N24 no afectan a la regulación de los sistemas de alta afinidad, Nrt2;1/Nar2 (Sistema I) y Nrt2;2/Nar2 (Sistema II), de C.reinhardtii. El nitrato clorato, agente inductor y tóxico respectivamente, entra al interior celular en presencia de amonio a través de sistemas de transporte de baja afinidad de nitrato. La causa princial del fenotipo CSA en los mutantes reguladores aislados es la despresión, parcial de la expresión de la nitrato reductasa en condiciones de inducción/represión (nitrato + amonio). Dicha desrepresión es mayor en el mutante N10 que en los dos mutantes N1 y N24. El estudio molecular de los mutantes Nrg se ha abordado mediante rescate plasmídico. En el mutante N24 (Nrg4) se ha aislado un fragmento de 1,4 kb adyacente a la inserción y que presenta cierta homología con factores de transcripción. En el caso del mutante N1 (Nrg1), se ha aislado mediante PCR inversa un fragmento de 2,5 kb usado para el escrutinio de una biblioteca de DNA cromosómico. Aislamos así un fragmento de aproximadamente 7Kb cuya subclonación y secuenciación nos ha permitido identificar en el locus Nrg1 un nuevo LTR-retrotransposón en C.reinhardtii de tipo gypsy que hemos denominado CrREM1. Este se encuentra en un bajo número de c