Función de los transportadores de potasio en la homeostasis de cationes en la levadura hansenula polymorpha

Resumen

RESUMEN DE LA TESIS DOCTORAL DE Dª María del Carmen Álvarez Morales 1. Introducción o motivación de la tesis La homeostasis de cationes es fundamental para las células vivas. Parámetros fisiológicos de relevante importancia para la célula como son el volumen celular, el pH intracelular, el potencial de membrana o la concentración interna de cationes dependen de los sistemas de entrada y salida de los principales cationes celulares, como son el sodio y el potasio. En este trabajo de Tesis hemos utilizado la levadura Hansenula polymorpha para avanzar en el estudio de la homeostasis de cationes en levaduras. H. polymorpha es una levadura ¿no convencional¿ de gran interés y potencial utilidad en procesos biotecnológicos. Se trata de una levadura metilotrófica y termotolerante, capaz de crecer a más de 50 ºC. De igual manera que en la levadura Saccharomyces cerevisiae, H. polymorpha posee dos genes que participan en el transporte de potasio, pero a diferencia de lo que sucede en la levadura modelo en la que ambos genes pertenecen a la misma familia (TRK1,2), en H. polymorpha existe sólo un representante de Trk (TRK1) y otro gen filogenéticamente diferente, denominado HAK1 (High-Affinity-K+). Utilizando mutantes en los sistemas de transporte de potasio de esta levadura, hemos caracterizado los requerimientos de potasio y la tolerancia a sal, hemos estudiado los flujos de potasio y sodio y asimismo hemos identificado algunos procesos implicados en su regulación. 2. Contenido de la investigación Los resultados de este trabajo mostraron que la disrupción de alguno de los genes de H. polymorpha, HAK1 o TRK1, condujo a un crecimiento defectuoso a concentraciones bajas de potasio, siendo este hecho especialmente relevante en el caso de la disrupción de HAK1. Los ensayos de flujo de Rb¿, como catión análogo al K¿, demostraron que el transportador Hak1 tiene una alta afinidad de absorción, mientras que la afinidad estimada para Trk1 fue varias veces inferior. Además, se concluyó que la expresión de HAK1 se induce en condiciones limitantes de K¿ y está regulada por la presencia de K¿, mientras que TRK1 no se regula transcripcionalmente. Con respecto al transporte de sodio, se ha demostrado que no hay un transporte específico de alta afinidad para este catión. Las cepas carentes del transportador Trk1 tienen una mayor sensibilidad a cationes tóxicos, acumulan mayor cantidad, transportan más rápido dichos cationes y manifiestan una mayor expresión del gen HAK1. Utilizando mutantes en calcineurina se ha demostrado que esta proteína fosfatasa juega un papel en la regulación de estos procesos. Los resultados sugieren que Hak1 funciona como un transportador de sodio (litio) en determinadas condiciones, y proponemos que TRK1 posee un papel fundamental en la tolerancia a sal actuando de forma indirecta a través de HAK1, lo que coincide con la idea de que los transportadores Trk pueden tener funciones adicionales a la de transportar potasio. Por último, cabe mencionar que por primera vez se han obtenido medidas del potencial relativo de membrana en H. polymorpha. En contra de lo publicado para la levadura modelo S. cerevisiae, la deleción o disrupción de los genes de transporte o el ayuno de potasio produce una despolarización celular que puede estar relacionado con la capacidad de acidificación del medio de estas levaduras. Este comportamiento plantea interrogantes de interés que han quedado pendientes de explicación en un futuro. 3. Conclusión En esta Tesis se han abordado diversos aspectos de la homeostasis de cationes en Hansenula polymorpha y se ha aportado información al estudio de la regulación del transporte de potasio y sodio en esta levadura. Hemos caracterizado los requerimientos y el transporte de potasio en H. polymorpha, y hemos estudiado la respuesta a estrés salino, siendo las conclusiones de este trabajo las siguientes: Los genes denominados HAK1 y TRK1 codifican los principales transportadores de potasio de Hansenula polymorpha. Hak1 es un sistema de transporte de potasio de alta afinidad requerido para crecer a bajas concentraciones de potasio. HpHAK1 está fuertemente regulado a nivel transcripcional y su expresión se estimula en condiciones limitantes de potasio. HpTRK1 no está significativamente regulado transcripcionalmente y parece mantener una expresión constitutiva. Trk1 tiene un papel fundamental en la halotolerancia de H. polymorpha. La ausencia de HpTRK1 provoca sensibilidad a sodio y estimula la expresión de HpHAK1, especialmente en presencia de sodio. Proponemos que a través del transportador Hak1 las células de H. polymorpha acumulan más cantidad de sodio y litio, haciendo a la cepa más sensible a estos cationes. En este proceso jugaría un papel importante la proteína fosfatasa calcineurina. Tanto el ayuno como la mutación de HAK1 o TRK1 inducen despolarización de las células de H. polymorpha. Este fenómeno es totalmente contrapuesto a lo descrito previamente en la levadura modelo S. cerevisiae. 4. Bibliografía Ariño J, Ramos J, Sychrová H. 2010. Alkali metal cation transport and homeostasis in yeasts. Microbiol Mol Biol. Rev. 74: 95-120 Cabrera E, Álvarez MC, Martín Y, Siverio JM, Ramos J. 2012. K(+) uptake systems in the yeast Hansenula polymorpha. Transcriptional and post-translational mechanisms involved in high-affinity K(+) transporter regulation. Fungal Genet Biol. 49: 755-63. Ramos J, Ariño J, Sychrová H. 2011. Alkali-metal-cation influx and efflux systems in nonconventional yeast species. FEMS Microbiol Lett. 317: 1¿8