EelnessTranscriptomic analysis of Vibrio-induced immune response in European eel

Resumen

La malaltia és l’alteració de l’estat fisiològic d’un individu, dificultant les seves funcions vitals i fins i tot, comportant a la mort. Tots els éssers vius poden contraure malaltia, aquesta, és majoritàriament provocada per microorganismes patògens, incloent bacteris, virus, protozous i fongs. Al llarg de la infecció, la relació hoste-patògen és clau. Per una banda, l’hoste ha de comptar amb un sistema immunitari eficaç, capaç de combatre l’infecció, mantenint les funcions vitals i per tant, evitant la mort. Per l’altre banda, el patogen desenvolupa una sèrie de factors per tal de aconseguir una invasió exitosa i per tant, provocant infecció. L’objectiu principal d’aquest tesi és l’estudi de l’interacció anguila-V. vulnificus mitjançant eines moleculars. L’anguila Europea (Anguilla anguilla) és una espècie de peix teleosti que durant els últims anys ha despertat un gran interès tan ecològic com econòmic. Es tracta d’una espècie amb un cicle de vida complicat. Els individus adults migren del continent Europeu fins al mar dels Sargassos (>5500Km), moment en que fan la seva maduració sexual, per tal de reproduir-se. Allà ponen i eclosionen els ous, les larves migren cap a la costa atlàntica europea on fan la metamorfosis a l’estadi juvenil i remunten els rius, on viuen i adopten la forma adulta (sexualment immadura), i tornen a migrar de tornada al mar dels Sargassos per reproduir-se. Per tant, és una espècie altament migratòria, la seva vida depèn fortament de les condicions ambientals marines, on passen gran part de la seva vida. En llibertat, la població d’anguiles es veu fortament afectada per varis factors naturals com el canvi climàtic, els canvis oceànics, la pèrdua d’hàbitat natural, la contaminació de l’aigua, l’obstrucció de les vies migratòries i els paràsits, a més a més, està patint una sobreexplotació pesquera important. Això, juntament amb les pròpies característiques biològiques de l’espècie com la maduració tardana, el cicle de vida llarg i que només ponen un cop a la vida, fan que la població sigui vulnerable a disminuir. De fet, des del 2008, està considerada una espècie en perill d’extinció (IUCN), ja que la l’estoc natural d’anguiles es troba fora dels límits biològics segurs i la pesca no és sostenible. La seva carn és molt apreciada per al consum, sobretot a països Asiàtics però també a Europa. Sumat al seu alt valor, fa que l’interés per aconseguir produir anguiles en captivitat hagi crescut. Les piscifactories d’anguiles, a part del problemes comuns dels sistemes de producció, com el control de malalties, tenen un problema afegit, a dia d’avui no s’ha aconseguit tancar el cicle reproductiu de l’anguila i per tant, la producció es basa en l’engreix d’individus capturats de la natura, contribuint així negativament en la conservació de l’espècie, disminuint la població natural i aplicant un model de pesca no sostenible. Per tant, les necessitats per incrementar el coneixement sobre la biologia de l’anguila per tal de resoldre el principals colls d’ampolla que afecten aquesta espècie, en llibertat i en captivitat, han crescut substancialment, fent de la recerca un pilar clau per la seva conservació i producció. Malgrat això, a dia d’avui ha sigut poc utilitzada en estudis d’investigació i la disponibilitat de recursos i eines específiques per al seu estudi son molt escassos, incloent a nivell molecular. Per tant, és de primordial necessitat el desenvolupament d’eines moleculars, genètiques, cel·lulars... per al seu estudi. Com s’ha mencionat abans, aquesta tesi es basa en l’estudi de l’interacció anguila-V. vulnificus. Més concretament Vibro vulnificus Bt2 SerE (CECT4999 o R99) que és el principal patogen bacterià capaç d’infectar anguiles, provocant la malaltia anomenada vibriosi d’aigua calenta tan en l’hàbitat natural com en captivitat. A més a més, pot provocar casos esporàdics de zoonosis per manipulació d’individus contaminats. La infecció natural en anguiles està composta bàsicament per tres passos, 1) la colonització de les brànquies, 2) l’entrada al torrent sanguini i 3) la distribució i infecció dels òrgans interns, provocant finalment la mort. La base genètica que dóna virulència a V. vulnificus es troba codificada dins un plàsmid de virulència anomenat pVvBt2, comú a totes les soques patogèniques per peix. L’únic gen de virulència conegut que s’ha trobat dins aquest plàsmid és la toxina rtxA13, que es troba per duplicat a R99, una còpia al cromosoma i l’altre al plàsmid. RtxA13 és descrit com el principal factor de virulència responsable de la vibriosi en anguiles, experiments amb la soca doble mutant, CT285, demostren que és avirulenta per anguiles, en canvi, mutants simples en una sola còpia, mostren un grau de virulència similar a la soca parental (R99). Els efectes tòxics de la toxina RtxA13 es donen en entrar en contacte amb cèl·lules eucariòtiques com, eritròcits, granulòcits, macròfags i inclús amebes; i a més, es sap que confereix resistència a la fagocitosis. El reconeixement bacterià per part de l’anguila no ha estat estudiat, tot i així, estudis sobre l’interacció de V. vulnificus amb models de mamífers si que ha estat descrit. Presumptament, el bacteri entra en contacte amb l’hoste i és reconeguda per els receptors de tipus toll (TLRs) que desencadenen una forta resposta inflamatòria conduint a la sèpsia. Segons els estudis publicats en mamífers, el bacteri seria reconegut bàsicament per TLR2 i TLR5, independent a TLR4, donant lloc a l’activació de NF-?B i per tant, activant la secreció de citoquines i quimioquines pro-inflamatories com IL-8, IL-6, TNF? i IL-1?. Per tal d’estudiar tant la resposta immunològica de l’anguila en vers V. vulnificus Bt2 SerE, com l’acció de la toxina RtxA13 durant l’infecció, s’han dut a terme infeccions in vivo amb ambdues soques, R99 i CT285. I el desenvolupament d’un cultiu de macròfags per estudis in vitro. Degut a la falta de recursos i eines específiques d’anguila per a l’estudi de l’interacció anguila-V. vulnificus, aquesta tesi ha estat subdividida en 3 seccions: a) El desenvolupament d’eines genòmiques. b) Experiments in vivo sobre l’interacció hoste-patògen. c) Desenvolupament d’un cultiu primari de macròfags per a l’estudi in vitro de la resposta immunològica. Desenvolupament d’eines genòmiques La disponibilitat de recursos genòmics d’anguila és molt limitada. En els últims anys, la base de dades genòmica s’ha incrementat considerablement gràcies diferents projectes de seqüenciació massiva, malgrat això, la descripció del sistema immunitari a nivell genòmic, i la disponibilitat d’eines moleculars modernes, per exemple microarrays, continua essent molt limitada. En aquesta secció s’ha dut a terme la seqüenciació de novo del transcriptoma de l’anguila enriquit immunològicament mitjançant seqüenciació massiva de segona generació, per tal d’obtenir i identificar gens relacionats amb el sistema immunitari. L’estratègia utilitzada va consistir en injectar individus adults amb diferents partons moleculars associats a patògens (PAMPs) com, lipopolisacàrids (LPS), Poly (I:C) i zymosan, per tal d’induir una resposta immunològica mimetitzant una infecció bacteriana, viral i per llevats. Al cap de 12h d’estimulació, els principals òrgans amb una funció rellevant dins el sistema immunitari com el fetge, la melsa i el ronyó anterior, van ser disseccionats per a l’extracció de RNA. A partir d’un pool normalitzat de un total de 48 mostres de RNA es va crear una llibreria de cDNA per a ser seqüenciat utilitzant la plataforma de Roche-454 GS FLX. El procés va donar lloc a més de 1.5x106 lectures d’alta qualitat que van ser ensamblades mitjançant el programa informàtic Newbler 2.3. Posteriorment es va dur a terme l’anotació de les seqüències mitjançant la recerca d’homologies amb seqüències proteiques i nucleiques de la base de dades de NCBI. El guió consistia en 4 passos combinant BLASTX ? BLASTN ? BLASTX ? BLASTN, fins a trobar la millor descripció per la seqüència d’interès. Malgrat la falta d’un transcriptoma de referència i la posició basal que ocupen les anguiles a l’escala filogenètica, lluny d’altres espècies ben descrites, l’anotació de novo va resultar en un total de 45067 noves descripcions. De les quals, aproximadament el 8% (978 transcripcions) d’aquestes han resultat ser transcripcions de gens involucrats en el sistema immunitari. Aquests inclouen, receptors com TLRs, receptors de cèl·lules T i B, receptors de quimioquines...; molècules de transducció del senyal com NF?B, MyD88, STAT6, TOLLIP, JNK, TRAF, TRIF, entre d’altres; i molècules eferents o de resposta com varies citocines, quimioquines, components del sistema complement, immunoglobulines... Aquesta base de dades, altament enriquida amb transcipcions de gens relacionats amb el sistema immunitari, ens ha permés dissenyar un microarray específic d’anguila (4x44K) amb alta representació d’aquests gens. El microarray està compost per 17500 anotacions diferents representades per duplicat o triplicat fent un total de 42403 sondes específiques d’anguila. A més a més, s’han seleccionat varis gens involucrats en el reconeixement i resposta de V. vulnificus en sistemes de mamífers com a candidats per l’estudi de la seva participació en la resposta de l’anguila com son tlr2, tlr5m, tlr5s i il-8. I altres coneguts per el seu paper en la senyalització i resposta del reconeixement de patògens pels diferents TLRs amb especial importància als involucrats en la resposta dels macròfags, com son myd88, il-18 i il-1?. Aquestes seqüències van ser analitzades detingudament mitjançant eines bioinformàtiques com son el BLAST per confirmar la identitat de la seqüència, l’ExPASy per la seva traducció a seqüències d’amino àcids i els programes SMART i InterProScan per localitzar els possibles dominis proteics que les componen. Posteriorment es va dur a terme un alineament múltiple amb seqüències del mateix gen corresponents a altres espècies de teleostis utilitzant el programa CLUSTALW2 per identificar les zones més conservades. Un cop analitzades i comprovada la seva identitat, es van dissenyar encebadors i sondes específiques per a l’estudi funcional d’aquests gens. Resumidament, en aquesta secció hem obtingut els recursos genòmics necessaris per al desenvolupament d’eines genòmiques específiques per a l’estudi a nivell molecular de l’anguila Europea, amb especial atenció al sistema immunitari, resposta i reconeixement. Experiments in vivo Les brànquies juntament amb la pell i l’anus, presenten un sistema immunitari mucosal (innat i adaptatiu) i actuen com a barrera física prevenint l’entrada de patògens. Quan el patogen és capaç d’eludir l’acció del sistema immunitari, actuen com a portal d’entrada. Per tant, un bon reconeixement i resposta immunitària en aquestes zones és el primer pas clau per evitar l’infecció. Els TLRs son els primers receptors que actuen en el sistema immunitari innat reconeixent els diferents PAMPs i desencadenant un seguit de senyals desembocant en la secreció de molècules efectores. Tot i això, és de primordial importància que el sistema sigui capaç de distingir entre microorganismes patògens i no-patògens per evitar una sobre-activació de la resposta. En mamífers s’ha descrit que V. vulnificus és reconegut per membres de la família dels TLRs (TLR2 i TLR5) que activen el factor de transcripció NF-?B donant lloc a la secreció d’IL-8, això ens fa pensar que en anguiles pot ser reconegut per la mateixa via. Per tant, es van escollir les seqüències corresponents a tlr2, tlr5, i il-8 per ser estudiades per qPCR i ISH. En teleostis TLR5 presenta 2 isoformes, soluble (tlr5s) i unit a membrana (tlr5m), ambdues es van identificar a la nostra base de dades i es van escollir per set analitzades. El mètode d’infecció de V. vulnificus Bt2 SerE a anguiles comença per la colonització de les brànquies. Tal i com s’ha comentat abans, la toxina RtxA13 produïda pel bacteri resulta ser el principal factor de virulència per l’anguila. Així mateix, s’ha demostrat que no és un factor de colonització ja que la soca doble mutant (CT285) és capaç de colonitzar les brànquies i entrar a l’organisme amb la mateixa eficiència que la soca salvatge, amb la única diferència que CT285 és completament avirulenta per anguiles. Per tant, objectiu d’aquest secció es centra en la descripció de la resposta immunològica de les brànquies de l’anguila Europea en vers V. vulnificus Bt2 SerE i el paper de la toxina RtxA13 en l’infecció, mitjançant l’ús de tècniques moleculars com la PCR a temps real (qPCR), la hibridació in situ (ISH) i els microarrays. Primerament es van dur a terme un seguit d’infeccions in vivo d’individus adults amb les soques R99 i CT285 per separat. Després d’1h d’immersió amb la LD50 corresponent a la R99 i l’estoc de peixos utilitzat (prèviament determinada), es transferien els individus en tancs amb aigua neta i es mostrejaven diferents teixits de l’hoste a 0, 1, 3, 6 i 12h amb diferents propòsits. Una porció de les brànquies, la sang, el fetge, la melsa i el ronyó anterior van ser utilitzat per avaluar i comprovar diferències en la capacitat de colonització i infecció per part de les dues soques. El recompte de bacteris viable es va dur a terme mitjançant la metodologia de recompte per goteig, els teixits es van trossejar en medi TSB i plaquejar en TSA. Els resultats obtinguts confirmen que rtxA13 no és necessària per la unió de V. vulnificus a brànquies i que ambdues soques es comporten igual en termes de colonització dels òrgans interns. Part de les brànquies van ser utilitzades per a l’extracció d’RNA i posterior anàlisis per qPCR. Una altre porció del mateix individu, per a la fixació en formalina i la posterior incrustació en parafina per dur a terme les ISHs. Tan per qPCR com per ISH es van analitzar els gens de tlr2, tlr5s, tlr5m i il-8. Els resultats obtinguts indiquen que tlr2, tlr5s, tlr5m i il-8 podrien estar involucrats en el reconeixement de V. vulnificus a curt plaç (1h després de l’infecció) però no ser essencials pel reconeixement a llarg plaç (6h després de l’infecció). La seva regulació transcripcional, estaria més relacionada als productes i danys provocats pel bacteri que no al nombre de bacteris, ja que, CT285 només és capaç de regular la expressió de tlr5s, en canvi la regulació de les altres transcripcions, tlr2, tlr5m i il-8, podrien ser dependents de la secreció de RtxA13. A més a més, els resultats podrien indicar que les dues isoformes de tlr5, ambdues reconeixen flagelina, podrien tenir una funció sinèrgica, actuant una després de l’altre i potenciant-se mútuament. Pel que fa als resultats de localització d’aquestes transcripcions en brànquies, totes es troben bàsicament en la segona lamel·la, la que està més en contacte amb el medi exterior, indicant així una possible predisposició al reconeixement de patògens. Tot i així, després de l’infecció amb la soca salvatge, la expressió de tlr2 s’expandeix a cèl·lules localitzades a la lamel·la primària, indicant així una possible migració de cèl·lules que expressen aquest receptor o bé, la inducció d’aquesta a cèl·lules localitzades en capes més internes com a resposta al pas del bacteri. Tot i que les tècniques moleculars clàssiques, en aquest cas qPCR i ISH, ens poden donar una bona aproximació sobre la implicació de gens seleccionats, tècniques moleculars modernes, com son els microarrays, ens permeten l’anàlisi del transciptoma a gran escala, oferint un gran ventall de possibilitats com la identificació de gens específics de resposta, gens de resistència a malalties, descripció de vies i xarxes involucrades a diferents processos... Per tal d’investigar quins gens, xarxes i processos estan involucrats durant l’infecció a curt, mig i llarg termini, el transcriptoma de les brànquies van ser analitzat a 0, 3 i 12h després de l’infecció amb R99 o CT285 utilitzant el microarray específic d’anguila dissenyat prèviament, enriquit amb gens del sistema immunitari. Els resultats indiquen que la funció immunològica de les brànquies actua a curt termini, sobretot durant la primera hora d’infecció. La resposta en vers la infecció amb R99 és més forta que amb CT285 indicant que la toxina RtxA13 podria ser essencial per desencadenar una resposta immunològica més eficient. Per altre banda, s’han pogut identificar gens de reconeixement i resposta regulats independentment a l’expressió/secreció de RtxA13, comuns a ambdues infeccions com son, el receptor il1r2, la molècula adaptadora comuna a les vies de senyalització dels TLRs, traf3, i la molècula de resposta immunològica mx. Les seqüències que mostren més sobre o sub-regulació com clec1 i mlrs, estan estretament relacionades amb l’ús del Ca2+ igual que els factors de virulència RtxA13 i VVC, per tant, això podria indicar que el metabolisme del Ca2+ és essencial tan per la defensa per part de l’hoste com per l’infecció per part del bacteri. Aquesta infecció també podria desencadenar la lisis de cèl·lules, independentment de l’acció de la toxina, reflectit amb la sobreexpressió de caspasa-3 suggerint l’activació de processos d’apoptosi cel·lular, i la sobreexpressió de caspasa-1 dependent de l’acció de RtxA13 suggerint una possible activació de processos piroptòtics. A més, varis gens relacionats amb la resposta de les cèl·lules T, i per tant amb la resposta immunològica adaptativa, estan regulats, suggerint la possibilitat de la presència del teixit limfoide interbranquial a anguiles, permetent una resposta ràpida del sistema immunològic adaptatiu. Desenvolupament d’un cultiu primari de macròfags L’objectiu d’aquesta secció és el desenvolupament d’un cultiu primari de macròfags d’anguila per l’estudi de la resposta immunològica in vitro. Els macròfags son les cèl·lules efectores més importants dels sistema immunitari. Tenen la capacitat de fagocitar patògens i de desenvolupar una resposta gràcies a la presència de diferents receptors de reconeixement de patògens (PRR) com son els TLRs. A partir de cèl·lules indiferenciades provinents del ronyó anterior (HK) i de leucòcits purificats de la sang per gradient de ficoll (PBLs), s’han obtingut cultius de cèl·lules diferenciades in vitro al cap de 72h i 48h respectivament. Mitjançant citometria de flux, microscopia òptica i confocal hem pogut demostrar que tot i ser un cultiu primari, hem aconseguit un cultiu altament homogeni on un gran percentatge de cèl·lules presenta el fenotip característic de les cèl·lules macrofàgiques, heterogeni, allargat, amb elongacions i un nucli arronyonat. Posteriorment la capacitat fagocítica d’aquestes cèl·lules va ser analitzada mitjançant l’estimulació dels cultius amb microorganismes (E. coli, S. aureus i Zymosan) marcats fluorescentment i la seva localització dins la cèl·lula avaluada per citometria de flux, microscopia de fluorescència i confocal. L’activació dels macròfags ve determinada per la interacció PAMPs-PRRs i l’activació de les seves vies de senyalització. Els cultius diferenciats es van estimular amb LPS i PGN d’E. coli, PGN de S. aureus i Zymosan, per l’avaluació de la resposta immunològica a nivell transcripcional, en vers a diferents PAMPs. Es va analitzar mitjançant qPCR l’expressió de seqüències que codifiquen per tlr2, myd88, il-18 i il-1?, conegudes per la seva presència i funció en macròfags. Els resultats demostren que aquest tipus cel·lular és capaç de respondre regulant aquests gens després de l’interacció amb el PGN però no amb LPS i que, el perfil de resposta depèn de la font d’obtenció de les cèl·lules ja que s’han obtingut diferents patrons d’expressió per el cultius provinents de HK i PBLs. Obtenint així un model in vitro que presenta les característiques morfològiques, fagocítiques i transcripcionals típiques dels macròfags, útil per l’estudi del sistema immunitari i per estudis d’interacció amb patògens.