Phenotypic and genotypic methods for differentiation of candida dubliniensis from candida albicans

Resumo

Candida Dubliniensis fue establecida como una especie nueva de levadura por primera vez en 1995. Es un patógeno oportunista asociado con episodios recurrentes de candidiasis oral en pacientes infectados por el VIH, y normalmente es un componente menor de la microbiota oral del ser humano. C. Dubliniensis comparte muchas características fenotípicas con Candida Albicans, con la que es fácilmente confundida. El objetivo principal de este estudio fue comparar los métodos mas comúnmente utilizados (fenotípicos y genotípicos) para la identificación de C. Dublinés y seleccionar los mejores métodos para la diferenciación entre C. Dublinés y C. Albicans. Las pruebas fisiológicas ensayadas fueron la morfología de las colonias en medios diferentes, producción de tubos germinales en suero, crecimiento a 45ºC, producción de clamidosporas en medios diferentes, y fluorescencia en agar Azul de Metileno-Sabouraud. Las pruebas bioquímicas utilizada fueron la prueba de asimilación de hidratos de carbono en el sistema API ID 32C, y producción de lipasas. Se ensayo también crecimiento en medios cromógenos diferentes. Las pruebas inmunológicas ensayadas incluyeron Bichro-Dubli Fumouze, inmunofluorescencia indirecta (IFI) con un antisuero policlonal de conejo contra C. dubliniensis, y el ensayo IFI con el anticuerpo monoclonal 12F7-F2. Los métodos genotípicos empleados fueron la PCR múltiple para la identificación de C dubliniensis y C. Albicans, el genotipado de C. Dubliniensis y secuenciación de algunos aislamientos de C. Dubliniensis. Se diseño un nuevo medio de cultivo (CHROM -Pal"s; preparado con el medio CHROMMagar Candida complementado con el agar de Pal), que permite la identificación presuntiva de C. Dubliniensis basada en el color y la morfología de las colonias, así como en la producción de clamidosporas. Se utilizo el medio CHROM-Pal"s para estudiar aislamientos almacenados de C. Dubliniensis, así como aislamientos primarios de levaduras obtenidos de 151 muestras orales de pacientes VIH- negativos atendidos en una clínica dental privada o en la clínica odontológica de la universidad del País Vasco y de 54 pacientes HIV- positivos atendidos en el Hospital de Cruces, Baracaldo. En este estudio también se obtuvieron anticuerpos monoclonales que permitían diferenciar C. Dubliniensis de C. Albicans. Se observo que la prevalencia de C. Dubliniensis en la cavidad oral de pacientes VIH-negativos era del 1.99% y del 18.5% en pacientes infectados por VIH. Entre los medios cromógenos comercializados, Candida ID2 (CAID2) era el mejor para la diferenciación entre las dos especies con una alta sensibilidad y especificidad comparado con CHROMagar Candida (CAC) y CHROMagar Candida BBL (CAC BBL). Sin embargo, el medio CandiSelect 4 no permitía distinguir entre las dos especies. El medio CHROM-Pals fue muy eficaz (9.7-100%) en la identificación presuntiva de aislamientos de C. dubliniensis (almacenados y primarios). El crecimiento a 45ºC fue otro método eficiente para la diferenciación entre C. Dubliniensis y C. albicans con alta sensibilidad y precisión. Se obtuvieron anticuerpos monoclonales contra C. Dubliniensis después de la inmunización de ratones Balb/c con el extracto de pared celular (DTT) de C. Dubliniensis. Los anticuerpos obtenidos en nuestro estudio fueron capaces de distinguir entre las dos especies por Western-blot, reaccionando con bandas proteicas especificas en el extracto de DTT de C. Dubliniensis que se diferenciaban de las de C. Albicans. Sin embargo no fue posible distinguir entre las dos especies por pruebas más simples como la inmunofluorescencia indirecta debido a la localización de los antígenos reconocidos en las capas profundas de la pared celular. Las pruebas realizadas con los aislamientos de C. Dubliniensis permitieron la observación de tres cepas que mostraron un patrón diferente. Los tres aislamientos eran del origen oral y pertenecían al genotipo 1. No eran cepas resistentes ni a los agentes antifúngicos ni a los inhibidores de crecimiento. No producían clamidosporas, presentaban una morfología lisa en medios especializados para el estudio de la morfología y fueron negativas con el Bichro-Dubli Fumouze, en contraste con el resto de los aislamientos de C, dublimiensis estudiados. Hemos denominado a estas tres cepas aislamientos atípicos de C. Dubliniensis.