Electroforesis capilar aplicada a la evaluación de ensayos in vivo con distintas sustancias

Resumen

En la presente Memoria se recogen los resultados mas relevantes obtenidos durante la realización de esta Tesis Doctoral, en la que se ha estudiado, empleando la Electroforesis Capilar como técnica de separación analítica, componentes con características nutraceuticas presentes en muestras de café, así como biomarcadores relacionados con el estrés oxidativo en matrices biológicas. En todos los estudios se han realizado ensayos in vivo, empleado animales de experimentación como ratas o ratones, con el fin de poder establecer resultados mas relevantes del comportamiento de estos analitos en el organismo. El trabajo llevado a cabo se ha centrado en dos partes que definimos a continuación: En primer lugar se estudió la cafeína y el ácido piroglutámico en muestras de café liofilizado y para ello se optimizó y validó un método de análisis por CE para la determinación simultanea de estos dos analitos. Posteriormente se valoró un numero de 11 muestras de café obtenidas al azar de varios supermercados y con los resultados obtenidos, se seleccionaron 4 tipos de café valorados que atendieran a variaciones en la concentración de cafeína y ácido piroglutámico y se procedió a estudiar la influencia que podían ejercer sobre la capacidad de aprendizaje y las propiedades cognitivas de un modelo animal. La segunda parte de este trabajo pertenece a un gran proyecto de investigación en el que extractos con conocidas propiedades antioxidantes procedentes de microalgas y plantas se han caracterizado y separado por otros equipos de investigación en una fase in vitro de estudio. En esta etapa pretendemos estudiar la influencia que ejercen sobre un modelo animal de estrés oxidativo como es la rata hecha diabética mediante estreptozotocina, en una primera fase de estudio in vivo. Para ello seleccionamos al glutation como uno de los biomarcadores mas importantes relacionado con el estrés oxidativo, ya que está presente en todas las células de organismo humano. Se presenta en su forma reducida (GSH) y en su forma oxidada (GSSG) y el equilibrio entre ambas formas, se ve afectado no sólo por las condiciones de estrés oxidativo de organismo, sino por factores externos. Es por este motivo por el que se optimizaron y validaron dos métodos por CE para la determinación de glutation en hígado y sangre total de rata. Durante todo este procedimiento se trató de estudiar el tratamiento de muestra mas favorable para la determinación de GSH y GSSG en condiciones reales en la matriz, sin verse afectadas por factores externos que camuflaran los resultados. En paralelo se desarrolló un modelo animal empleando la diabetes como modelo de estrés oxidativo, y se valoró la influencia que ejercía el tiempo de diabetes, las dosis de antioxidantes, y el sexo, sobre los valores de concentración de glutation en hígado y sangre total de ratas. Una vez se estableció un modelo animal de rata macho con 14 días de diabetes, se procedió a estudiar la influencia que ejercían extractos con conocidas propiedades antioxidantes, previamente estudiados, aislados y caracterizados por otros equipos de investigación como son la Dunaliella salina y por otro lado el Rosmarinus oficinalis, sobre los valores de glutation presentes en el hígado y en la sangre total de rata. Finalmente se llevó acabo el desarrollo de un método de separación por CE para la determinación de 3-nitrotirosina, como posible biomarcador de estrés oxidativo, en orina de ratas diabéticas, empleando el estudio de metodos de preconcentración on- line por electroforesis capilar que permita minimizar el tratamiento de la muestra e incrementar los limites de detección en esta técnica, ya que la 3-nitrotirosina se presenta en concentraciones muy bajas. Para ello se empleó la modalidad de stacking de (inyección de gran volumen de muestra) o Large Volume Sample Stacking (LVSS).