Identificación y caracterización molecular e inmunológica de la serina/treonina proteína fosfatasa PPH-1 de angiostrongylus costaricensis

Zusammenfassung

Las enfermedades parasitarias tienen una gran importancia clínica y veterinaria, ya que la prevalencia global de infección por nematodes parásitos, probablemente excede a cualquier otra infección. Se estima que un tercio de la población mundial alberga una infección con helmintos intestinales (Trichuris trichiura, Ascaris lumbricoides, Strongyloides stercolaris, uncinarias); y más de 150 millones están infectados con alguno de los parásitos filariales patógenos (Wuchereria bancrofti, Brugia malayi, Loa loa) (Caballero, 1998). Asimismo, los nematodes parásitos son un serio problema en la ganadería e industrias cárnicas, se estima que causan pérdidas por valor de 23 mil millones de euros anuales, incluídos los gastos derivados de las medidas para evitar la infección es decir la rotación y los tratamientos. Estos tratamientos al igual que los utilizados en humanos, son en su mayoría poco eficaces por diversas causas (Lanusse y Prichard, 1993). Siendo Haemonchus, Trichostrongylus y Ostertagia los principales causantes de parasitosis en ganadería (McLeod, 1995; Poglayen y Battelli, 2006; Stromberg y Gasbarre, 2006). Existen otras enfermedades menos conocidas causadas por nematodes, como es el caso de la angiostrongylosis abdominal. Esta enfermedad fue descrita por primera vez en Costa Rica y es producida por el nematode Angiostrongylus costarricensis (Morera y Céspedes, 1971). En Costa Rica se presentan unos 500 casos anuales. Hasta el momento se han descrito casos desde el sur de Estados Unidos hasta el norte de Argentina, sin embargo, la distribución geográfica real no ha sido aún bien establecida debido al poco conocimiento que aún existe sobre esta parasitosis (Morera, 1998). Esta infección se ha observado en niños costarricenses desde 1952 pero no se describió hasta 1971(Morera y Céspedes, 1971). Los hospedadores definitivos naturales del parásito son roedores de las especies Sigmodon hispidus, Rattus rattus y Oryzomis spp; los hospedadores intermediarios son moluscos de la familia Veronicellidae.El hábitat final del parásito son las arterias mesentéricas, principalmentea nivel de la región ileocecal (Morera, 1971). El ser humano es hospedador accidental, la enfermedad se produce al ingerir larvas inefectivas mediante alimentos contaminados. La infección se caracteriza por una fuerte reacción inflamatoria a nivel de la pared intestinal y por la aparición de una serie de síntomas inespecíficos. Los casos severos pueden conducir a la muerte, sobre todo si el cuadro se presenta en niños. Debido a la fuerte reacción inflamatoria las formas larvales de primer estadio (L1) no son capaces de alcanzar la luz intestinal, por lo que un diagnóstico coproparasitológico de la infección es imposible. Hasta la fecha, sólo se puede confirmar la presencia del parásito mediante el estudio anatomopatológico depiezas quirúrgicas. Como métodos diagnósticos complementarios se emplean pruebas inmunológicas que intentan determinar la presencia de anticuerpos específicos contra Angiostrongylus costarricensis en el suero de los pacientessospechosos. Estas pruebas presentan reacciones cruzadas, las cuales afectan la especificidad y por ende la fiabilidad de las mismas (Abraham y col., 2004). Asimismo, el único tratamiento existente es la extracción de la porción del intestino afectada, ya que no existe ningún fármaco eficaz y algunos se relacionan con migración del nematode (Morera, 1985). Por todo esto es necesario el desarrollo tanto de un diagnóstico como un tratamiento eficaz no invasivo. En los últimos años se ha incrementado la resistencia frente a los antihelmínticos y esto crea aun mas la necesidad de desarrollar tratamientos eficaces frente a las parasitosis causadas por nematodes. Para el desarrollo de nuevos antihelmínticos se requiere conocer aun mas sobre la biología de los nematodes. Elconocimiento básico sobre los parásitos de mayor importancia socio-económica, se ha incrementado en los últimos 20 años. Este aumento del conocimientoha sido en gran medida a la creación de bases datos que agrupan los genes descritos de cada parásitos, así como al desarrollo de nuevas técnicas que facilitan el conocimiento de las funciones de dichos genes (RNAi y microarray). El mecanismo llamado RNAi fue descubierto recientemente y se basa en que pequeñas cadenas de RNA asociadas con proteínas que se unen específicamente a el mRNA y lo fraccionan. Este mRNA fraccionado es posteriormente digerido, silenciando así la expresión de genes. El RNAi es usado por muchos eucariota (desde protozoos hasta el hombre), este mecanismo fue probablemente desarrollado como una defensa natural contra RNA viral y transposones. Fue descubierto en Caenorhabditis elegans (Fire y col., 1998) y posteriormente se ha demostrado su presencia en muchos otros organismos modelos. Estudios posteriores en Caenorhabditis elegans han demostrado que en los nematodes hay una expansión del mecanismo catalítico del RNAi gracias a la presencia de RdRP que crea mas siRNAs (Fire y col., 1998). Por esto actualmente este mecanismo es considerado como una prometedora herramienta terapéutica contra un sin número de enfermedades, ya que se no tendría efectos secundarios ni acumulativo, como es el caso de los fármacos actualmente usados, asimismo es una técnica rápida para la identificación de las funciones de los genes. En el caso de nematodes, la técnica RNAi ha sido empleada para la identificación de las funciones de diferentes genes, lo cual ha permitido identificar diferentes genes con posibles aplicaciones terapéuticas para el control de varias enfermedades causadas por diferentes especies de nematodes parásitos. Reportes actuales demuestran la utilización del mecanismo de RNAi en nematodes parásitos, como: Brugia malayi (Aboobaker, 2003), Haemonchus contortus (Geldhof, 2005), Onchocerca volvulus (Lustigman y col., 2004), Nippostrongylus brasíliensis (Hussein y col., 2002), Ascaris suum (Islam y col., 2005b), Trichostrongylus colubriformis (Issa y col., 2005), Schistosoma japonicum (Cheng y col., 2005). Aunque este aumento del conocimiento ha permitido la identificación de varias proteínas como dianas terapéuticas, la vacunación contra helmintos parásitos representa una alternativa prometedora al tratamiento con antihelmínticos (Albonico y col., 1995). Las vacunas por lo general son de fácil uso, estimulan naturalmente el sistema inmune, son más seguras en términos de ecotoxicidad y carecen de residuos que sean perjudiciales y sigan la cadena trófica, además de mejorar la calidad de vida de las personas. Sin embargo hasta el momento las únicas vacunas que han sido comercializadas son frente a Dictyocaulus viviparus y están fabricadas con organismos vivos atenuados, es el caso de las vacunas para el uso en ganado vacuno Huskvac (Intervet) y Dictol (Schering Plough Animal Health), sin embargo su uso es cada vez mas reducido debido alpeligro y coste que supone el manejo de material biológico vivo y su obtención (Baink, 1999; Loukas y col., 2006). Por esto los antígenos nativos y recombinantes son otra opción vacunal, aunque las proteínas nativas son difícilmente obtenidas en cantidades suficientes debido a la dificultada del mantenimiento de los ciclo biológicos de dichos nematodes parásitos, así como el riesgo de su manejo. Por lo cual las proteínas recombinantes y los péptidos sintéticos se convierten en la opción mas adecuada, aunque hasta el momento no se ha conseguido un nivel de protección alto con este tipo de vacunas. Este trabajo presenta la identificación del gen putative serine/threonine protein phosphatase pph-1 (EMBL: AM041130). Esta gen ha sido caracterizado, y se ha determinado que su expresión es mas alta en L3 que en los demás estadíos del ciclo de vida, y que la localización de la proteína que codifica es citoplásmica en diferentes tejidos como intestino, órganos reproductores y cutícula. Al mismo tiempo, con objeto de desarrollar una metodología que permitiese inhibir la expresión de este gen, tanto para identificar los efectos de esta inhibición, como para evaluar un posible uso terapéutico de esta metodolog ía, se seleccionó una diana de siRNA con ayuda del programa Sfold, cuya eficacia fue evaluada mediante experimentos in vivo en cultivos celulares, mediante un sistema de expresión de luciferasa. También se ha ensayado el potencial inmunoprotector de esta proteína, para lo cual se ha empleado la proteína recombinante en combinación con proteínas bacterianas y un péptido sintético. Los resultados demuestran una protección del 100% y 80% respectivamente. Por lo cual proponemos esta proteína para su uso potencial como vacuna, protegido por la patente con número de registro: P200800565.