Caracterización de dos caseína quinasas 1 de trypanosoma cruzi

Résumé

Los objetivos de la tesis fueron: 1,- Identificar, mediante el rastreo de una librería de expresión, secuencias relacionadas con la familia de caseína quinasas 1 en T.cruzi. 2,- Caracterizar molecularmente el gen de la CK1 de T.cruzi para conocer su organización genómica y su expresión a lo largo del ciclo de vida del parásito. 3,- Desarrollar un sistema de expresión heterólogo de la enzima CK1 de T.cruzi, E.coli y purificar la enzima recombinante para caracterizar sus propiedades bioquímicas. 4,- Desarrollar un sistema de expresión homólogo de la CK1 para estudiar el efecto de inhibidores de otras CK1 tanto en el crecimiento como en la infectividad de T.cruzi. Siguiendo los objetivos planteados, y utilizando una sonda obtenida por PCR de la zona conservada de CK1, se aislaron dos secuencias cDNA que codifican para dos isoformas CK1 en T.cruzi. Una de las isoformas, TcCK1.1, tiene 936 pb y la otra, TcCK1.2, tiene 990 pb. Estas isoformas codifican para proteínas de 36 y 37 kDa, respectivamente. Mediante el uso de sondas específicas para cada una de las isoformas hibridas contra Southern blots se pudo determinar que TcCK1.1 es un gen de dos copias y TcCK1.2 está multiplicado en tándem. La separación de cromosomas por electroforesis de campo pulsado reveló que ambos genes se localizan en dos cromosomas de más de 2 Mb. El modelaje teórico de la estructura de ambas isoformas revela diferencias con respecto a otras CK1 cristalizadas, en los residuos que hacen a la proteína funcional o interaccionan con ella. Al hibridar nothern blots con las sondas específicas para cada gen, se determinó que ambas isoformas se expresan diferencialmente en los diferentes estadíos de vida de T.cruzi, presentando una mayor expresión (a la altura de ARN) en el estadío infectivo, para TcCK1.1, y en la forma intracelular amastigota, para TcCK1.2. La expresión global de las CK1 en T.cruzi revela niveles significativamente más e