Sistemas de diagnóstico para la detección de anticuerpos específicos en pacientes con cuadros de queratitis causados por especies de acanthamoeba, acanthamoebidae

Résumé

Entre las amebas de vida libre consideradas como anfizoicas, por su potencial capacidad patógena para el hombre, se encuentran las especies pertenecientes al género Acanthamoeba, que incluye una serie distribuidas de forma ubicua en el ambiente. Encontrándose sus trofozoítos o quistes en la tierra, aire, aguas tratadas para consumo o incluso en aguas de hospitales y donde la fase de trofozoíto es capaz de acceder a hospedadores vertebrados incluido el hombre y desarrollar una serie de afecciones a veces muy graves que pueden comportar desde la pérdida de visión al infectar la córnea terminando en la pérdida de visión del ojo afectado, principalmente en usuarios de lentes de contacto hasta a la muerte por afectación cerebral causando una meningoencefalitis granulomatosa amebiana. El cultivo de muestras cornéales en agar no nutritivo ha sido el método más usado en el laboratorio ante la sospecha clínica de la afectación ocular. Sin embargo, el escaso rendimiento del diagnóstico, la tardanza en obtener los resultados del cultivo, 8 días de promedio, y el tipo de muestra requerida, un raspado corneal o biopsia, la cual debe ser obtenida por un médico especialista mediante un procedimiento doloroso y a veces traumático, conlleva a obtener unos resultados donde el tiempo de inicio de tratamiento lo hace vital para poder obtener resultados satisfactorios en el paciente por lo que es de importancia la detección lo antes posible del agente etiológico de la enfermedad. El objetivo principal de este trabajo ha sido estandarizar y validar sistemas de diagnóstico para la detección de anticuerpos específicos en pacientes con cuadros de queratitis causados por especies de Acanthamoeba spp que podrían ser candidatos para apoyar el diagnóstico de laboratorio de este tipo de cuadro ocular. Para iniciar el trabajo de esta tesis se consideró de importancia conocer los genotipos de Acanthamoeba presentes en las queratitis amebianas en Chile, país en el cual se realizó el presente trabajo. Para ello se estudiaron mediante caracterización genética, 114 muestras obtenidas de 76 pacientes cuyas cepas fueron aisladas entre los años 2005 y 2016, siendo el principal tipo de muestra estudiada la proveniente de aislados de raspado corneal. En todos los casos los pacientes a los que se aisló en más de una muestra se pudieron comprobar que todas ellas pertenecían al mismo genotipo. Esta caracterización genética realizada a las cepas de pacientes de Acanthamoeba provenientes de cuadros de queratitis, constituye el primer estudio de este tipo llevado a cabo en Chile. Por otra parte, se pudo evaluar como la mayor parte de los pacientes con muestras positivas, corresponde a pacientes del sexo femenino, que se podría explicar por el mayor uso de lentes de contacto. Al estudiar los genotipos identificados se obtuvo que el más común correspondió al genotipo T4, con 24 variantes, que coincide con lo publicado en otros lugares donde se ha realizado estudios similares. Solo 5 cepas fueron identificadas como T11, y un solo aislado se identificó como perteneciente a T2. Tras estudio de los genotipos presentes en muestras clínicas y la selección de una cepa de Acanthamoeba genotipo T4 proveniente de un paciente con un cuadro de queratitis y la cepa de Acanthamoeba rhysodes adaptada a cultivo in vitro, permitieron seleccionar el uso del cultivo proveniente de la cepa T4 para la preparación de los antígenos necesarios en la estandarización de los sistemas diagnósticos incluidos en esta tesis. En la primera parte de este trabajo se estandarizaron tres sistemas de diagnóstico para la detección de anticuerpos específicos en sueros de pacientes con un cuadro de queratitis probablemente causado por Acanthamoeba spp. Se emplearon para ello, 88 muestras correspondientes 35 a pacientes con cuadros de queratitis y 53 personas voluntaria sin cuadros de queratitis. Los sistemas diagnósticos estandarizados fueron a ELISA, Inmunofluorescencia indirecta (IFI) y Western blot (WB). En el caso de la determinación de anticuerpos específicos en suero por el método de ELISA se obtuvo reactividad en la totalidad de los sueros estudiados, sin embargo, al establecer un valor de corte para esta técnica se obtuvo una sensibilidad del 66,7 % y una especificidad del 83 %, lo que se traduce en un porcentaje del 78,9 % de correcta clasificación de la prueba. Los resultados obtenidos por Inmunofluorescencia indirecta IgG mostraron un patrón de reactividad para todos los sueros, por lo que fue necesario proponer un título de corte de 1:80 para diferenciar los positivos de los negativos, lo que llevó a obtener una sensibilidad del 100 % con una especificidad de 88,7%, superiores a los encontrados para ELISA con un porcentaje de clasificación correcta superior al 91,5%. Analizando mediante un modelo de regresión logística el reconocimiento antigénico mediante Western blot se pudo establecer un patrón diagnóstico formado por las bandas de 100, 70, 65 y 60 kDa que, al aplicar la prueba de ajuste, fue capaz de predecir la presencia de enfermedad en los pacientes con diagnóstico de queratitis. Los resultados de la regresión logística pudieron interpretarse en el contexto de la presencia o ausencia de infección por Acanthamoeba spp al aplicar el modelo para las diferentes combinaciones de bandas. La prueba de Western blot identificó 17 de los 18 sueros de pacientes con queratitis y cultivo positivo y solo dos muestras pertenecientes a personas sin cuadros de queratitis que fueron calificadas como positivas, lo que se traduce en valores de sensibilidad y especificidad del 94,4% y 96,3% respectivamente. El elevado porcentaje de correcta clasificación obtenido en la prueba de WB ( 95,8%) al compararlo con los valores para ELISA IgG (78,9%) e IFI IgG (91,5%) posiciona al Western blot como la técnica de elección para el diagnóstico serológico de la queratitis por Acanthamoeba. Tras la validación de los métodos mediante los protocolos EP12 – A2, el método de ELISA IgG solo cumplió uno de los parámetros considerados en la validación, lo que le lleva a ser descartado este método como apoyo al diagnóstico clínico de la queratitis amebiana. Tampoco fue posible considerar a la técnica de Inmunofluorescencia indirecta por no disponer de un panel de sueros con títulos reconocidos y certificados que permitiera la realización de los protocolos. En contraposición el método de WB cumplió con todos los requisitos necesarios para validar el uso clínico de esta herramienta como apoyo al diagnóstico de cuadros sospechoso de queratitis por Acanthamoeba spp, por lo que podría ser presentado en un proceso de acreditación bajo la Norma ISO 15.189. La técnica de ELISA usando IgA secretora se propuso en una segunda etapa de este trabajo como una alternativa a los sistemas diagnósticos estandarizados para suero La técnica estandarizada fue capaz de detectar correctamente a 4 de los 5 pacientes con diagnóstico clínico de queratitis por Acanthamoeba spp, no obstante, el paciente con resultado negativo resultó igualmente negativo en los estudios de cultivo y PCR no evidenciándose por tanto la parasitación por las amebas. Dicha técnica mostró una sensibilidad del 80% y una especificidad del 80% así como un porcentaje del 80% de correcta clasificación. Sin embargo, se hace necesario incluir un mayor número de muestras para corroborar estos resultados preliminares tan prometedores. En función de los resultados obtenidos en esta tesis se proponen dos algoritmos de trabajo que tienen como objetivo disminuir los tiempos de respuesta diagnostica a 24 horas, y que actualmente pueden extenderse hasta 10 días en los casos sospechosos de queratitis. Lo que redundará sin duda en que se adopte un tratamiento rápido y específico para esta enfermedad.