Relación entre klotho y el fenómeno inflamatorio en la enfermedad vascular aterosclerótica

  1. Ernesto Martín Núñez
Supervised by:
  1. Juan Francisco Navarro González Director
  2. Javier Donate Correa Director

Defence university: Universidad de La Laguna

Year of defence: 2020

Committee:
  1. Pablo Martín Vasallo Chair
  2. José Manuel Valdivieso Revilla Secretary
  3. Pablo Ureña Torres Committee member

Type: Thesis

Teseo: 636733

Abstract

Antecedentes. La aterosclerosis es el proceso patológico que subyace en la gran mayoría de enfermedades cardiovasculares (ECV), siendo estas la primera causa de muerte y morbilidad a nivel mundial. La base de esta lesión es el desarrollo de una respuesta inflamatoria que se amplifica y cronifica en la pared del vaso a causa de la pérdida de homeostasis vascular asociada, habitualmente, con la aparición y falta de control de uno o varios factores de riesgo cardiovascular (edad, tabaquismo, hipertensión arterial, diabetes mellitus, obesidad o hiperlipidemia). Este escenario se suele acompañar de un ambiente inflamatorio sistémico de bajo grado que redunda en el desarrollo del daño vascular. El papel central que juega el fenómeno inflamatorio en la aterogénesis lo señala como un proceso biológico susceptible de proporcionar dianas terapéuticas útiles en el tratamiento de dicha patología. Es por ello que se realizan esfuerzos por elucidar efectores, reguladores y vías de señalización capaces de modular el proceso inflamatorio asociado a la lesión aterosclerótica. En años recientes, el factor antienvejecimiento α-Klotho (KL) se ha convertido en una molécula de alto interés en el contexto de la salud cardiovascular. En humanos, este factor ha sido relacionado con diversos trastornos cardiovasculares tales como enfermedad arterial coronaria, insuficiencia cardíaca, calcificación vascular o enfermedad arterial periférica. Diferentes estudios experimentales han demostrado un efecto de prevención o atenuación del daño vascular tras la administración de KL, sugiriendo potenciales implicaciones terapéuticas. Un aspecto relevante sobre su biología es la relación recíproca que mantiene con distintos elementos del fenómeno inflamatorio, de modo que factores proinflamatorios son capaces de modular la expresión de KL y, a su vez, este es capaz de reprimir la respuesta inflamatoria a distintos niveles. Aunque no se conocen en detalle los mecanismos moleculares detrás de las propiedades protectoras de KL sobre el árbol vascular, nosotros postulamos que su actividad antiinflamatoria podría jugar un papel importante en el marco de la lesión aterosclerótica. Objetivo. El objetivo principal de esta tesis doctoral es la caracterización de la relación entre el factor KL y la enfermedad vascular aterosclerótica, así como sus interrelaciones con el fenómeno inflamatorio. Metodología. Se ha desarrollado un estudio de casos y controles, que incluyó a pacientes con diagnóstico de enfermedad vascular aterosclerótica clínica sometidos a cirugía vascular electiva y a individuos donantes de órganos cadavéricos sin antecedentes médicos indicativos de enfermedad cardiovascular, respectivamente. Los individuos de ambos grupos tuvieron el mismo rango de edad (51-82 años) y función renal preservada (todos con FGe>60mL/min/1,73m²). Se ha determinado el perfil de expresión de KL en células circulantes de sangre periférica (CCSP) y en pared arterial mediante qPCR, y en esta última además mediante inmunohistoquímica, así como las concentraciones séricas de la forma soluble mediante inmunoensayo ELISA, estudiándose la relación de estos con la presencia de lesión vascular y con marcadores inflamatorios –proteína C reactiva (PCR), ratio neutrófilo/linfocito, expresión vascular y en CCSP de los genes TNF e IL10 y de sus proteínas en vasculatura, niveles sistémicos de TNFα e IL10, y la ratio entre ambas citoquinas a nivel génico (TNF/IL10) y proteico (TNFα/IL10)–. Además, se ha valorado el grado de metilación del promotor del gen KL en pared vascular y su asociación con marcadores inflamatorios con el fin de considerar su posible implicación como mecanismo regulador de este factor en el daño aterosclerótico. Resultados. Los pacientes con diagnóstico clínico de aterosclerosis mostraron reducciones significativas en la expresión de KL tanto a nivel vascular (52,1% del ARNm y 45,8% de proteína en pared vascular) como en CCSP (73,7% del ARNm), así como un descenso en los niveles séricos de la forma soluble (50,4%), en comparación con el grupo control. El grupo de casos presentó un estado proinflamatorio en comparación con el grupo control, marcado por mayores niveles de PCR, mayor expresión del gen TNF en pared vascular y en CCSP, reducción en la expresión del gen IL10 en CCSP y en los niveles sistémicos de la citoquina soluble, y valores más elevados de la ratio TNF/IL10 en pared vascular y CCSP, así como de TNFα/IL10 a nivel sistémico. Al considerar la presencia o ausencia de lesión aterosclerótica en los fragmentos vasculares procedentes de pacientes, no se observaron diferencias en la expresión del KL endógeno vascular si bien los niveles de expresión génica en CCSP o los niveles séricos de sKL fueron significativamente menores en aquellas muestras que mostraron daño ateromatoso visible (con descensos de un 33,3% para el ARNm en células y de un 16,6% para la proteína circulante). El análisis estratificado por terciles de expresión génica de KL o de concentración de sKL reveló una disminución en la incidencia de placa aterosclerótica visible con el aumento de la expresión génica en CCSP y de los niveles séricos de la proteína soluble. El análisis de correlaciones bivariante mostró, por una parte, la asociación significativa y directa de la expresión de KL en pared vascular con la de IL10 en CCSP y, por otra, asociaciones significativas tanto de la expresión génica de KL en CCSP como de las concentraciones séricas de sKL con diversos parámetros inflamatorios de la pared vascular, de las propias CCSP y a nivel sistémico. Por otra parte, los resultados de los modelos de regresión lineal múltiple mostraron que diversos parámetros clínicos e inflamatorios presentaron asociaciones con la expresión de KL en CCSP (TNF/IL10 vascular y en CCSP, expresión de TNF vascular, colesterol y fósforo) y las concentraciones séricas de sKL (TNFα/IL10 sérico, presión arterial sistólica, índice de masa corporal y fósforo), pero no con su expresión génica en la pared vascular. En un análisis multivariante de regresión logística, la expresión de KL en vasculatura y CCSP y los niveles circulantes de sKL fueron factores protectores frente a la aparición de ECV, mientras que la edad, el tabaquismo, los niveles de PCR o la ratio TNFα/IL10 sérica aparecieron como factores de riesgo. Así mismo, los factores de riesgo para el desarrollo de lesión aterosclerótica visible fueron el tabaquismo o los valores de la ratio TNFα/IL10 sérica, mientras que la expresión de KL en CCSP o la concentración de sKL fueron factores de protección. Por último, se constató un mayor grado de metilación del promotor del gen KL en pared vascular en el grupo de casos (71,4% vs. 39,4) presentando, además, una correlación inversa con la expresión de dicho gen y las concentraciones sistémicas de IL10, y directa con la expresión de DNMT1, NFKB1 y TNF. Conclusiones. La enfermedad vascular aterosclerótica es un estado de deficiencia de KL a nivel vascular, de CCSP y de circulación sistémica, siendo estos elementos, que se asocian de forma inversa con diversos parámetros inflamatorios, protectores frente a esta patología. Así mismo, las asociaciones entre los niveles séricos de sKL o su expresión génica en CCSP con la presencia de placas ateroscleróticas y con marcadores inflamatorios en la pared vascular sugieren un posible papel modulador de los elementos sistémicos del factor antienvejecimiento sobre la respuesta inflamatoria en la pared del vaso y el desarrollo de lesiones avanzadas. Además, el proceso de metilación del promotor del gen KL en la vasculatura es un mecanismo asociado con la respuesta inflamatoria que explicaría la reducción de este factor en la lesión aterosclerótica.