Evaluación de la proteína granzima a como marcador diagnóstico, pronóstico y de respuesta al tratamiento en pacientes con cáncer colorectal

  1. María José Domper Arnal
Supervised by:
  1. Angel Lanas Arbeloa Director
  2. Angel Ferrández Arenas Director

Defence university: Universidad de Zaragoza

Year of defence: 2021

Committee:
  1. Enrique Quintero Carrión Chair
  2. Francesc Balaguer Prunés Secretary
  3. Marta Castro López Committee member

Type: Thesis

Teseo: 691333 DIALNET

Abstract

1. INTRODUCCIÓN El cáncer colorectal (CCR) supone aproximadamente el 10% de todos los canceres diagnosticados, así como un porcentaje similar de las muertes totales por cáncer en la población mundial. Es el segundo cáncer más frecuentemente diagnosticado en mujeres y el tercero en hombres. La carcinogenesis es el resultado de una interacción compleja entre factores celulares intrínsecos y extrínsecos que promueven la proliferación celular, la resistencia a la apoptosis, la reprogramación y reorganización del microambiente tumoral y la inestabilidad genómica. La inflamación, aunque es necesaria para la reparación del daño celular y la activación de la inmunidad del huésped para enfrentarse a patógenos y células transformadas, puede influir en todos estos procesos para promover el desarrollo de cáncer. Las granzimas (GZMs) son una familia de serín-proteasas originariamente identificadas en los gránulos citosólicos de los linfocitos T citotóxicos (LTc) y las células Natural Killer (NK). Los resultados en humanos y en ratones sugieren que la granzima B (GZMB), pero no la granzima A (GZMA), está involucrada en el control de la homeostasis del microambiente del CCR. En base a la solidez de los datos experimentales, GZMA está emergiendo como la opción terapéutica más viable dentro de la familia GZM para prevenir y / o tratar el cáncer, especialmente los canceres en los que la inflamación juega un papel clave, como en el CCR. La inhibición de la inflamación mediada por GZMA podría ser beneficiosa a diferentes niveles, incluida la prevención del desarrollo del cáncer, la progresión del cáncer (es decir, el desarrollo de metástasis) y la mejora de la eficacia de otros medicamentos que se conoce que pueden ser afectados por el microambiente inflamatorio. Consideramos que es muy probable que la proteína inflamatoria GZMA mediante la modificación de proteínas del medio extracelular (ECM), influyendo en los procesos de transición epitelio-mesénquima (EMT), pueda inducir una peor evolución de los procesos tumorales inflamación-dependientes como es el CCR. Su expresión puede verse influida por parámetros dependientes del diagnóstico (localización del CCR, estadio, marcadores histológicos en la pieza quirúrgica…), por parámetros dependientes del tratamiento, entendido como influencia de la expresión de GMZA en la respuesta al mismo o como modificación de su expresión en función del mismo y por parámetros pronósticos del CCR en términos de supervivencia libre de enfermedad (DFS), supervivencia libre de progresión (PFS), supervivencia global (OS) y supervivencia por CCR. Su inhibición, parece que no influye en el desarrollo de otras neoplasias o procesos infecciosos graves, por lo que podría ser una diana terapéutica segura para modificar la evolución de los pacientes con CCR. 2. HIPÓTESIS La GZMA es una proteína proinflamatoria expresada principalmente por los LTc y las células NK en el microambiente tumoral del CCR y su expresión se puede relacionar con un peor pronóstico en estos pacientes. Debido a lo anterior, esta proteína podría ser una potencial diana terapéutica en un futuro para esta enfermedad. 3. OBJETIVOS 3.1. OBJETIVOS PRIMARIOS 1) Analizar la presencia de GZMA en la mucosa cólica tumoral, en el margen invasivo peritumoral y en la mucosa sana más alejada de la zona del tumor en pacientes con CCR y determinar si existe alguna relación, respecto a la tinción de GZMA, entre las zonas estudiadas. 2) Determinar si los niveles tisulares de GZMA se relacionan con el diagnostico (principalmente estadio tumoral y marcadores histológicos en pieza quirúrgica), tratamiento (respuesta al mismo y relación con el tipo de tratamiento recibido) y pronostico (DFS,PFS, OS) de los pacientes con CCR. 3.2. OBJETIVOS SECUNDARIOS 1) Desarrollar y optimizar la técnica de inmunohistoquímica (IHQ) para la detección de GZMA en tejido cólico de pacientes con CCR. 2) Ampliar el conocimiento sobre el papel de la GZMA en la génesis y desarrollo del CCR en humanos en la práctica clínica habitual con técnicas estándar como la IHQ. 4. MATERIAL Y MÉTODOS Se trata de un estudio de centro único, retrospectivo, de cohortes. Analizamos pacientes con CCR diagnosticados con colonoscopia entre noviembre de 2006 y junio de 2012, candidatos a cirugía colónica y con pieza quirúrgica disponible. Se realizó IHQ para GZMA en 3 zonas: Tejido sano alejado del tumor, margen invasivo peritumoral y tejido tumoral y se evaluó la tinción para GZMA (pos++/pos+/int/neg). Se recogieron datos demográficos, relacionados con el diagnóstico y tratamiento del CCR, así como relacionadas con el pronóstico del mismo (DFS, PFS,OS, supervivencia por CCR) . Se realizó un seguimiento mínimo de 5 años. La selección de la población a estudio se realizó a través de una base de datos propia de pacientes con CCR diagnosticados mediante colonoscopia del servicio de aparato digestivo del Hospital Clínico Universitario “Lozano Blesa” (HCULB). La recogida de información de cada paciente se realizó desde las fuentes de datos de intranet del HCULB, el acceso a la historia clínica electrónica unificada de Aragón, el acceso a la base de datos de familiares de pacientes con CCR del servicio de aparato digestivo del HCULB y la información del registro oficial de la mortalidad de Aragón. Este estudio ha sido aprobado por el Comité Ético de Investigación Clínica de Aragón (CEICA). 5. RESULTADOS 5.1. VARIABLES DESCRIPTIVAS POR PACIENTE Y TUMOR Contamos para el estudio con 228 pacientes procedentes del HCULB de Zaragoza diagnosticados de CCR mediante colonoscopia entre noviembre de 2006 y junio de 2012, candidatos a cirugía colica por cualquier motivo relacionado con su CCR y de los que se dispone de pieza quirúrgica. Los pacientes tienen una edad media al diagnóstico de 71,3+/-10,4 años, con un rango de 37-90 años. El 50% de los pacientes tiene 73 años o más (RIQ: 65,3-78,8). El 61,0% son hombres (139/228). La indicación de la realización de la colonoscopia diagnostica del CCR motivo de inclusión en el estudio es en el 98,2% de los casos síntomas. Durante el seguimiento, un 24,6% de los pacientes ha tenido alguna recurrencia (56/228), un 19,3% de los pacientes ha tenido progresión (44/228) y un 46,9% de los pacientes ha fallecido (107/228). Un 6,6% de los pacientes (15/228) tiene un segundo tumor, en 6 casos se trata de un tumor sincrónico (2,6%) y en 9 casos de un tumor metacrónico (3,9%), lo que supone 243 tumores a estudio. Un 33,7% de los tumores a estudio (82/243) se localizan en colon derecho, un 32,9% en colon izquierdo (80/243) y un 33,3% en recto (81/243). Respecto al estadio TNM I-IV, la distribución fue 14,4 % estadio I, 34,2 % estadio II, 34,6% estadio III y 11,9 % estadio IV. En un 99,2% de los tumores analizados la histología se corresponde con el subtipo adenocarcinoma (241/243). En el análisis de la pieza quirúrgica, el 22,2 % (54) presentaban invasión vascular, el 23,5% (57) invasión linfoide y el 16,9% (41) presentaban un subtipo histológico de adenocarcinoma mucinoso. En 20 de los 243 tumores (8,2%), se ha realizado análisis de inmunohistoquímica para MLH1, MSH2, MSH6 y PMS2, con expresión normal de todas las proteínas analizadas. Un 98,4% de los tumores ha precisado tratamiento quirúrgico (239/243) y un 1,2% tratamiento endoscópico (3/243). De los 36 tumores que precisaron tratamiento neoadyuvante (36/243), 3 recibieron tratamiento quimioterápico (1,2%) dirigido a tratar las metástasis hepáticas que presentaban y 33 recibieron tratamiento neoadyuvante dirigido al tumor primario rectal. De los tumores que recibieron tratamiento adyuvante, 6 tumores de los 243 (2,5%) precisaron solo RT, 77 solo QT (31,7%) y 19 ambos tratamientos (7,8%). Un 16,0% de los tumores (39/243) precisaron QT con intención paliativa de entrada o a lo largo de la evolución de su enfermedad. 5.2. RESULTADOS EN RELACIÓN AL OBJETIVO PRIMARIO 1: EXPRESIÓN GRANZIMA EN TEJIDO Y RELACIÓN DE LAS ZONAS ESTUDIADAS Los datos de los que se dispone para el estudio, partiendo de la variable de IHQ con cuatro categorías (Estandar: NEG, INT, POS, POS++) para GZMA en función de las zonas analizadas, son: TEJIDO SANO (S) n=204 tumores TEJIDO PERITUMORAL (PT) = MARGEN INVASIVO n=237 tumores TEJIDO TUMORAL (T) n=237 tumores A partir de la variable estándar de IHQ, se han creado variables combinadas en referencia a los resultados de tinción de IHQ para GZMA. Los resultados fundamentales hacen referencia a la variable estándar y a la variable combinada IHQ_CAT5: neg Vs (int+pos+pos++). Distribución de la tinción para IHQ GZMA estándar (neg, int, pos, pos++) en tejido sano, peritumoral y tumoral. RELACION ENTRE EL TEJIDO SANO – PERITUMORAL (n=202) Existe relación entre los niveles de IHQ en tejido peri tumoral y tejido sano. El 24,7% de los Pos++ en tejido peritumoral son Pos++ también en tejido sano. El 90,9% de los Pos++ en tejido peritumoral son Pos o Pos++ en tejido sano. Existe relación estadísticamente significativa entre la distribución de la tinción de IHQ GZMA en tejido sano y en tejido peritumoral para todas las combinaciones posibles de variables de tinción de IHQ GZMA (estandar y combinadas), con p<0,001 en todas las asociaciones evaluadas. RELACION ENTRE EL TEJIDO SANO – TUMORAL (n=201) Evaluadas todas las variables posibles (estándar o combinadas) para la IHQ GZMA, ninguna muestra relación significativa en la asociación de resultados de tinción entre tejido sano y tejido tumoral. RELACION ENTRE EL TEJIDO PERITUMORAL-TUMORAL (n=236) Existe relación entre los niveles de IHQ GZMA en tejido peritumoral y en tejido tumoral, de tal forma que los pacientes con tinción Pos o Pos++ en tejido tumoral tienen mayor probabilidad de ser también Pos o Pos++ en tejido peritumoral. Variable IHQ estándar GZMA (p=0,003). 5.3. RESULTADOS EN RELACIÓN AL OBJETIVO PRIMARIO 2: RELACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE GRANZIMA A CON LAS VARIABLES DEPENDIENTES DEL DIAGNÓSTICO, PRONÓSTICO Y TRATAMIENTO DEL CCR GRANZIMA A Y DIAGNÓSTICO DE CCR No se observa relación estadísticamente significativa entre la indicación de la colonoscopia (síntomas/cribado-vigilancia), la localización del CCR y su estadio con los resultados de tinción de IHQ GZMA (p≥0,05). El grado de diferenciación tumoral analizado en la muestra a estudio, no presenta una relación significativa con los resultados de tinción de IHQ GZMA para ninguna de las variables consideradas (p≥0,05). Lo mismo ocurre con la presencia o no de invasión vascular. En relación con la invasión linfoide, existe una relación estadísticamente significativa entre invasión linfoide si/no y la variable estándar de tinción de IHQ GZMA en tejido sano (p=0,033) y en tejido peritumoral (p=0,031), pero no en tejido tumoral (p=0,874). En referencia a la subclasificacion de la histología del tumor como adenocarcinoma mucinoso, se observa una relación estadísticamente significativa entre la presencia o no de células positivas a GZMA en el interior del tejido tumoral IHQ_CAT5 (neg, int+pos+pos++) y la variable tumor mucinoso si/no, de tal forma que, un 87,8% de los tumores mucinosos presentan categoría neg para IHQ_CAT5 frente al 69,5% de los tumores no mucinosos (p=0,036). GRANZIMA A Y TRATAMIENTO DEL CCR Se ha evaluado la relación entre la administración de tratamiento neoadyuvante (quimioterapia y/o radioterapia) y la tinción de IHQ para GZMA y no se ha encontrado una relación significativa entre ambas variables (p≥0,05). Lo mismo ocurre en relación con la administración de tratamiento adyuvante. En el estudio de la respuesta al tratamiento neoadyuvante en la pieza quirúrgica, para los 33 tumores rectales en los cuales ha sido preciso, no se observa asociación entre la respuesta (parcial o completa) a dicho tratamiento y las diferentes variables de tinción IHQ para GZMA GRANZIMA A Y PRONÓSTICO DEL CCR Existen diferencias significativas entre las curvas de DFS en función de la tinción de IHQ de GZMA evaluada en el tejido tumoral para la variable de tinción estándar (p=0,043) y para la variable de tinción IHQ_CAT5 (p=0,015; HR=0,390 (0,180-0,850)). No existen diferencias significativas entre las curvas de PFS en función de la tinción de IHQ de GZMA evaluada en el tejido sano, peritumoral y tumoral para la tinción estándar ni para la IHQ_CAT5 GZMA. Se ha realizado un estudio de OS, supervivencia por CCR y supervivencia por otras causas con cortes de temporalidad en 1 ano, 5 años, y total del seguimiento. En el estudio de OS para el seguimiento total del estudio, en relación con la tinción de IHQ GZMA por variables combinadas existen diferencias significativas para la tinción IHQ_CAT5 de tal forma que los pacientes que expresaron GZMA en tejido peritumoral tuvieron un riesgo superior de fallecimiento por todas las causas respecto a los que tuvieron una expresión negativa: GZMA (pos++/pos+/int) vs GZMA (neg) en tejido peritumoral: p=0,022; HR: 3,530 (IC95%: 1,120- 11,200). En el estudio de la supervivencia por CCR para el seguimiento a total, en relación con las variables combinadas de IHQ GZMA, vistos los resultados anteriores en relación a la supervivencia global y, por tanto, centrando los mismos en la variable IHQ_CAT5 GZMA (neg Vs (int, pos, pos++)) no existen diferencias estadísticamente significativas en función de dicha tinción (p≥ 0,05). 6. DISCUSIÓN Evaluado en conjunto los resultados y teniendo en cuenta la literatura previa, en nuestro estudio la mayoría de linfocitos NK y CD8+ que expresan GZMA se encuentran en el tejido sano y principalmente en el tejido peritumoral. Los linfocitos presentes en el tejido tumoral que expresan GZMA provienen del tejido peritumoral y son aquellos que han logrado superar la barrera físico-química del tumor. La expresión de GZMA en los diferentes tejidos (sano/peritumoral/tumoral) no se relaciona ni con la localización ni con el estadio (I-IV) ni con el tratamiento recibido en los pacientes con CCR hecho que apoya la idea de que la acción dañina de esta proteína en la génesis del CCR está presente desde el inicio de la carcinogenesis y que los tratamientos que se administran en la práctica habitual no tienen una relación estadística con su expresion tisular. De manera significativa o, mostrando una clara tendencia, la expresión de GZMA en tejido tumoral se relaciona con una mejor supervivencia por CCR y DFS. Los tumores mucinosos, clásicamente catalogados como con un peor pronóstico, presentan una expresión significativamente menor de GZMA en tejido tumoral. De manera significativa o, mostrando una clara tendencia, la expresión de GZMA en el tejido peritumoral se relaciona con una peor OS y supervivencia por CCR en el seguimiento total y a los 5 años, así como una peor DFS y PFS. FORTALEZAS Se trata del primer estudio que divide la expresión proteica de GZMA en tres zonas diferentes en tejido histológico (sano/peritumoral/tumoral) en pacientes con CCR. Estas zonas a estudio no habían sido valoradas previamente de manera conjunta para esta enfermedad ni en el mismo grupo de pacientes. Se ha llevado a cabo la optimización y puesta a punto de una técnica de IHQ no comercializada y para la que se disponía de escasos datos en su interpretación en muestras de pacientes con CCR. La dificultad la entrañaba tanto la valoración del grado de tinción para considerar la expresión como positiva, como la valoración del número medio de células positivas por zona de estudio, así como la gradación de los resultados de la técnica en POS++, POS+ INT, NEG. Teniendo en cuenta el tamaño muestral relativamente pequeño, se demuestra en los resultados como la expresión de la IHQ GZMA en este estudio no se relaciona de manera estadísticamente significativa con la localización y estadio TNM (I-IV) de los pacientes con CCR, algo que puede proponerla como diana terapéutica en pacientes en cualquier estadio tumoral y en pacientes con diferentes mutaciones proteicas que en muchas ocasiones dependen de la localización del tumor (MSI, BRAF, KRAS). Se trata, de la primera vez que se demuestra como la expresión de esta proteína influye en el pronóstico de los pacientes con CCR, principalmente como marcador de mal pronóstico en pacientes que expresan GZMA en tejido peritumoral. DEBILIDADES Se trata de un estudio retrospectivo, unicéntrico, de pequeño tamaño muestral, con dificultades en la recogida de datos. Así mismo destacamos la multitud de bases de datos que ha sido necesario consultar para recoger toda la información del estudio. Existe una falta de estudio de la expresión de múltiples mutaciones que se realizan en la actualidad como es el estudio de IMS y las mutaciones BRAF o KRAS en pacientes con CCR. Debido a que la inmensa mayoría de la población a estudio se ha diagnosticado mediante colonoscopia diagnostica, no sabemos si la misma población diagnosticada en programas de cribado de CCR se comportaría de igual modo. Desconocemos el comportamiento de la expresión de esta proteína en lesiones precursoras de CCR tales como adenomas o pólipos serrados. 7. RESUMEN La GZMA es una proteína relacionada con la inflamación que se expresa en pacientes con CCR con independencia de la localización y estadio TNM (I-IV) de la enfermedad. Su presencia en el tejido peritumoral se relaciona con un peor pronóstico en términos de DFS, PFS, OS y supervivencia por CCR, por lo que debe ampliarse los conocimientos al respecto para plantear esta proteína como un marcado pronostico y/o una diana terapéutica en este tipo de pacientes. Debido a que la inhibición de esta granzima, en comparación con GZMB, no se ha demostrado que influya en el desarrollo de otras neoplasias o infecciones y que es una diana más especifica que la QT convencional, el perfil de seguridad es potencialmente alto. Respecto al uso de esta proteína como marcador pronostico y/o diana terapéutica, los posibles pacientes candidatos serian aquellos en estadio II en los que podría ayudar a decidir que pacientes necesitan QT adyuvante o pacientes en estadio III para ayudar a decidir que pacientes precisan QT de ciclo largo. En los pacientes en estadios metastásicos se podría valorar como tratamiento coadyuvante en función del perfil mutacional global presente. 8. CONCLUSIONES - Se ha desarrollado y validado un anticuerpo monoclonal de ratón con aplicación para la detección de GZMA humana en muestras de tejido mediante IHQ. -La mayoría de células de morfología linfoide que expresan GZMA se encuentran en el tejido sano y principalmente en el tejido peritumoral. -La expresión de GZMA en los diferentes tejidos (sano/peritumoral/tumoral) no se relaciona ni con la localización ni con el estadio TNM (I-IV) ni con el tratamiento recibido en los pacientes con CCR. -La expresión de GZMA en tejido tumoral se relaciona con una mejor supervivencia por CCR y DFS. -La expresión de GZMA en el tejido peritumoral se relaciona con una peor OS y supervivencia por CCR en el seguimiento total y a los 5 años, así como una peor DFS y PFS. - La expresión de GZMA debe ampliarse como línea de estudio en los pacientes con CCR ya que podría tratarse de un potencial marcador pronostico y/o diana terapéutica en este tipo de cáncer.