Desarrollo y evaluación de técnicas de pcr en tiempo real para la detección y cuantificación de anisakis (nematoda, anisakidae) en pescado y productos procesados

Abstract

La presencia de nematodos del género Anisakis en pescado representa un peligro potencial para los consumidores por su capacidad de causar patología a nivel gastrointestinal y/o reacciones alérgicas. Es importante desarrollar métodos de detección y cuantificación específicos que permitan preservar la calidad e inocuidad del pescado y de sus productos derivados. Se optimizaron técnicas de SYBR Green qPCR y TaqMan qPCR utilizando los cebadores ANIKIT y QCYTCII que amplifican un fragmento de ITS-1 y Cox-2, respectivamente. Para analizar la especificidad y sensibilidad, se aislaron larvas de pescados como la bacaladilla, el rape y el jurel (Atlántico NE y Mediterráneo Oeste), identificadas morfológicamente como Anisakis simplex sensu lato (s.l.) (n=510), Anisakis physeteris (n=3), Hysterothylacium sp. (n=283) y Pseudoterranova sp (n=1). Larvas del complejo A. simplex (s.l.) fueron analizadas por PCR-RFLP para identificar las especies gemelas Anisakis simplex sensu stricto y Anisakis pegreffii. Para los análisis de linealidad, reproducibilidad y sensibilidad, se construyó un sistema binario, contaminando experimentalmente una matriz alimentaria con larvas lisadas de A. simplex (s.l.), en concentraciones de 1,36 x104 a 1,36 x10-3 ng de ADN de Anisakis por gramo. Los estudios de especificidad indicaron que los cebadores ANIKIT amplifican las larvas de Anisakis y Pseudoterranova, mientras que los cebadores QCYTCII fueron específicos para Anisakis. Se observó un comportamiento lineal desde la concentración 1,36 x104 a 1,36 x10-1 ng de ADN de A. simplex (s.l.) por gramo para los tres métodos. Después de un análisis PROBIT, el límite de detección (LOD 95%) para ANIKIT y QCYTCII SYBR Green qPCR fue de 0,18 y 0,30 ng/g respectivamente, similar a 0,25 ng/g reportado por TaqMan qPCR. Se seleccionó la técnica QCYTCII SYBR Green qPCR para estudiar la presencia de Anisakis en alimentos procesados derivados del pescado, analizándose 180 muestras de gulas, croquetas, palitos de cangrejo y hamburguesas de 15 marcas comerciales. Se detectó ADN de Anisakis en 4/5 marcas de gulas, 1/3 de croquetas y 4/6 de palitos de cangrejo, encontrándose las mayores concentraciones, aunque a nivel de trazas, en gulas y palitos de cangrejo (5,38±0,72 y 4,46±0,77 ng/g). Se desarrolló un modelo matemático descriptivo- QCYTCII SYBR Green qPCR para estimar el número de larvas de Anisakis en pescado Para ello, se contaminaron experimentalmente filetes de merluza con diferente número de larvas (0-50) de A. simplex (s.l.). Se observó una relación logarítmica entre los valores Cq y el número de larvas presentes en la muestra obteniendo una función descriptiva (Cq= -1,529x + 24,109) (R2 =0,9908; CV=2,37%). El modelo se validó con el estudio de la carga parasitaria de 25 bacaladillas del Atlántico NE, analizadas en paralelo por inspección visual, observándose una concordancia del 95% entre el número de larvas observadas visualmente y el número de larvas estimado por el modelo. Por otro lado, el estudio de la parasitación de boquerones del Atlántico NE, 30 de la costa de Portugal y 30 del Golfo de Vizcaya, fue realizado utilizando en la mitad de los especímenes de cada zona el modelo descriptivo desarrollado y en la otra mitad la inspección visual, sin encontrase diferencias significativas (P=0,77).