Transmisión por transfusión de la enfermedad de Chagas. Estudio de la carga parasitaria y viabilidad de Trypanosoma cruzi en los componentes sanguíneos y valoración de métodos de reducción de patógenos mediante herramientas moleculares

Laburpena

[spa] La investigación desarrollada en el presente trabajo se ha dirigido a estudiar la presencia y viabilidad de Trypanosoma cruzi en diferentes componentes sanguíneos, para profundizar en el conocimiento de la transmisión por transfusión (TT) de la enfermedad de Chagas, así como a diseñar y optimizar una herramienta molecular basada en la detección de DNA (PMA-qPCR), que permita diferenciar parásitos vivos y muertos aplicada a ensayos de viabilidad del parásito de manera simple, precisa y de fácil aplicación sobre distintas matrices. La presencia del parásito se ha estudiado en sangre y en componentes sanguíneos (plasma y plaquetas obtenidos por aféresis) de donantes seropositivos de la Fundació Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears, provenientes de zonas endémicas de la enfermedad de Chagas que residen en las islas Baleares. Además, se han llevado a cabo estudios en sangre total experimentalmente infectada y separada mediante fraccionamiento clásico para conocer su distribución en plasma, placa leucoplaquetaria y fundamentalmente en concentrado de hematíes, que ha sido recientemente citado como un componente sanguíneo involucrado en un caso de transmisión por transfusión de T. cruzi. Así mismo, se han evaluado los actuales métodos de leucorreducción y tecnologías de reducción de patógenos utilizados en los bancos de sangre, para valorar su efectividad en disminuir tanto la carga parasitaria como la viabilidad del parásito en estudios experimentales. Para llevar a cabo estos estudios se han utilizado herramientas moleculares sensibles y específicas que han permitido detectar y cuantificar tanto DNA como RNA del parásito, mediante tecnologia qPCR con sondas TaqMan y con SYBR Green. La búsqueda de posibles donantes seropositivos con parásitos detectables en sangre, para ser incluidos en el estudio, ha permitido obtener datos sobre la seroprevalencia de la enfermedad de Chagas en los donantes, siendo ésta de 1,9%. Además ha permitido detectar que el 60,9% presentaban parasitemia, con cargas menores a 1 parásito equivalente por mL. El estudio para determinar la presencia del parásito en los componentes sanguíneos obtenidos mediante plaqueto/plasmaféresis, ha mostrado que la mayor carga parasitaria se localiza en las plaquetas (5,33±6,12 parásitos equivalentes/mL) y no en el plasma, con un valor promedio cinco veces mayor que en sangre periférica (0,42±0,32 parásitos equivalentes/mL), lo que confirma el riesgo de TT asociado a este componente sanguíneo ya documentado en los diferentes casos publicados de transmisión. En el estudio experimental de sangre total infectada y separada mediante fraccionamiento clásico, los componentes sanguíneos con mayor concentración de parásitos detectados han sido la placa leucoplaquetaria y el concentrado de hematíes sin leucorreducir. La elevada carga parasitaria encontrada en el concentrado de hematíes sin leucorreducir evidencia el riesgo asociado a TT por este componente sanguíneo, que decrece significativamente cuando es sometido a leucorreducción mediante filtración, observándose una reducción de 99,9%. Por otro lado, los estudios realizados en sangre total infectada experimentalmente para evaluar la efectividad de un filtro leucorreductor, han mostrado la presencia de un remanente de parásitos viables, que no han sido detectados después de haber sido sometidos a la tecnología de reducción de patógenos basada en riboflavina y luz ultravioleta. Ello indica el interés de utilizar ambos métodos de modo conjunto para eliminar el riesgo de TT. La importancia de conocer la viabilidad de las formas parasitarias y simplificar las metodologías de estudio, llevó a diseñar y a optimizar la técnica cruzi PMA-qPCR que utiliza el colorante propidio monoazida (100 mM PMA), capaz de unirse covalentemente al DNA e impedir su posterior amplificación, pero incapaz de atravesar membranas íntegras de células vivas. El método ha permitido una reducción promedio de la señal de qPCR de 2,5 unidades de logaritmos y un porcentaje de reducción de 98% entre en las concentraciones de parásitos 10 5 viables y no viables ensayados (10-1 x10 parásitos/mL). Esta técnica permite diferenciar entre epimastigotes de T. cruzi vivos y muertos, por lo que puede ser utilizada como un método de viabilidad y cuantificación mediante detección de DNA, aplicable tanto en diagnóstico como investigación. [eng] The presence and viability of Trypanosoma cruzi in different blood components was studied to shed light on the transfusion-transmission (TT) of Chagas disease. To carry out these studies, molecular methods for parasite DNA and RNA detection and quantification based on real time PCR were used, as well as serologic methods for donor screening. Plasma and platelets obtained by apheresis from seropositive blood donors at the Fundació Banc de Sang i Teixits de les Illes Balears who lived in endemic areas before moving to the Balearic Islands wer e tested for the presence of the parasites. T. cruzi antibodies were detected in 1.9% of donors, and 60.9% of these presented parasitemia. Parasite distribution was uneven: while undetectable in plasma, it was 5-fold higher in platelets than in peripheral blood, thus confirming the reported association between this blood component and the risk of Chagas disease TT. Additionally, whole blood experimentally infected with T. cruzi was analyzed, and the highest concentration of parasites was found in the buffy coat and pre- leukoreduced red blood cells. The leukoreduction and pathogen reduction technology currently used in blood banks were evaluated for their effectiveness in reducing the parasitic load and viability. A significant reduction of the parasite load was observed after leukoreduction of red blood cells by filtration, although a remnant of parasites was still detected. However, when a leukoreduction filter was used together with riboflavin and UV light, all the viable parasites in the infected whole blood were removed. This indicates the effectiveness of the joint application of both systems for eliminating viable T. cruzi in whole blood. Since RNA detection is difficult in biological samples, a molecular tool based on DNA detection (PMA-qPCR) was designed and optimized for the viability assays, with the aim of developing a simple and accurate method applicable to different matrices. Using 100 µM PMA, this technique differentiated between viable and non-viable T. cruzi epimastigotes, with a mean signal reduction of 2.5 log10 and 98% reduction between live and dead parasites. Therefore, this could be a suitable method to quantitate viable parasites applicable in both diagnosis and research.