Design, synthesis and in vitro evaluation of novel (sub)phthalocyanine- based photosensitizers for photodynamic therapy

  1. Winckel, Eveline van de
Dirigida por:
  1. Tomás Torres Cebada Director/a
  2. Andrés de la Escosura Navazo Director/a

Universidad de defensa: Universidad Autónoma de Madrid

Fecha de defensa: 24 de febrero de 2017

Tribunal:
  1. José Luis Mascareñas Cid Presidente/a
  2. Luis Sánchez Martín Secretario/a
  3. Santi Nonell Marrugat Vocal
  4. Rosa Anita Fernandes Vocal
  5. David Díaz Díaz Vocal

Tipo: Tesis

Resumen

Introducción y Objetivos El principal objetivo de esta Tesis Doctoral es la síntesis de nuevas ftalocianinas (Pc) y subftalocianinas (SubPc) para su aplicación como fotosensibilizadores (PS) en terapia fotodinámica (PDT: photodynamic therapy). La PDT es una forma de fototerapia aprobada clínicamente que se emplea tanto en el tratamiento de enfermedades oncológicas como en la inactivación de microorganismos. En este último caso, también se puede utilizar el término aPDT (antimicrobial PDT) o PDI (photodynamic inactivation). Aparte de un PS, el elemento central en PDT, el tratamiento requiere la presencia de dos componentes más: luz de una longitud de onda adecuada y la presencia de oxígeno molecular (3O2). Tras la irradiación del PS en su máximo de absorción, éste se excita a su estado singlete excitado (1PS*), un estado inestable y de corta duración que, a su vez, puede sufrir una inversión del spin del electrón excitado (ISC, intersystem crossing) dando lugar al primer estado triplete excitado (3PS*), un estado más estable y con tiempo de vida más largo. En consecuencia, en este estado el PS tiene la posibilidad de interactuar con el 3O2 presente en el medio biológico, un triplete en su estado fundamental, generando así formas reactivas de oxígeno (ROS, reactive oxygen species) y oxígeno singlete (1O2). Ambos causan daño oxidativo dentro de los tejidos diana, resultando así en la destrucción de células tumorales en el caso de la PDT, y en la inactivación de microorganismos en el caso de la PDI. Como es bien sabido, el PS ideal debe cumplir con una serie de requisitos básicos para producir resultados óptimos. Debe presentar por ejemplo una elevada estabilidad química y fotoquímica, solubilidad en medios biológicos, y altos rendimientos cuánticos del estado triplete y de generación de 1O2. Además, el PS debe carecer de toxicidad en ausencia de luz y debe mostrar selectividad hacia los tejidos diana. En este sentido, el desarrollo de nuevos PS con mejores propiedades y específicamente diseñados para su aplicación en PDT y/o PDI es un campo de investigación de gran actualidad. En general, los PS se dividen en dos grandes familias: los no porfirinoides y los porfirinoides. Hasta ahora, los porfirinoides han sido la familia más estudiada y con más éxito, dando lugar a varios PS aprobados clínicamente en los últimos años. Por lo tanto, en esta tesis nos PDIPDTCancer cellHongosBacteriasParásitosVirusANTIBIÓTICA 4 Resumen y Conclusiones centramos en el desarrollo y el estudio de derivados porfirinoides como PS, más concreto en ftalocianinas de silicio (SiPcs) y SubPcs. Las Pcs son macrociclos aromáticos constituidos por cuatro unidades de isoindol unidas entre sí por puentes de nitrógeno, cuya nube de 18 electrones π sufre una deslocalización sobre los 16 átomos del anillo interno. En consecuencia, las Pcs poseen una banda Q muy intensa a longitudes de onda relativamente largas (650-750 nm), que se encuentran dentro de la ventana óptica terapéutica, permitiendo así una penetración de luz más profunda en los tejidos. Además, las Pcs presentan una gran versatilidad estructural gracias a que pueden alojar en su cavidad central hasta 70 elementos de la tabla periódica, y a que poseen 16 posiciones periféricas en los anillos bencénicos, en las cuales se pueden introducir diversos sustituyentes. Según la naturaleza del metal alojado, es también posible introducir diferentes sustituyentes en posición axial. Gracias a esta versatilidad química y a sus excelentes propiedades fotofísicas, las Pcs son candidatos prometedores como PS. Sin embargo, debido a su inherente superficie aromática hidrófoba, las Pcs presentan dos principales limitaciones para su uso como PS, como son la ausencia de solubilidad en medio acuoso y la elevada tendencia a formar agregados. Ambos restringen la eficiencia de los procesos relacionados con el estado excitado tales como la fluorescencia o la producción eficiente de 1O2 a través del estado triplete. No obstante, la agregación se evita fácilmente empleando sustituyentes voluminosos en la periferia o en las posiciones axiales del macrociclo. En este sentido, las SiPcs son empleadas con éxito en PDT, ya que permiten la introducción de dos sustituyentes en las posiciones axiales, lo que suprime su tendencia a agregar. Además, una buena selección de los sustituyentes axiales puede proporcionar a la SiPc un aumento de solubilidad en medio acuoso. Las SubPcs, por otro lado, son homólogos inferiores de las Pcs, constituidas por tres unidades de isoindol unidas entre sí por puentes de nitrógeno. En su cavidad central siempre se aloja un átomo de boro tetracoordinado, que se halla unido a tres átomos de nitrógeno de las unidades de isoindol y a un sustituyente que ocupa la posición axial de la molécula. Parecido a las Pcs, su sistema aromático consta de una nube de 14 electrones π que están deslocalizados sobre el anillo aromático interno, resultando en una banda Q muy intensa a longitudes de onda ligeramente más cortas. Por rayos X se ha determinado PSLuz3O20.000.200.400.600.801.001.20260460660Absorbancia/ a.u.Longitudde onda/ nmSubPcSiPcSubPcsSiPcsPORFIRINOIDESNO -PORFIRINOIDES Resumen y Conclusiones 5 que, a diferencia de las Pcs, las SubPcs no son planas, sino que muestran una estructura cónica. Esto, junto con la presencia del sustituyente axial, implica que las SubPcs son menos susceptibles a agregarse, lo cual es una gran ventaja para su uso como PS. Además, estos macrociclos presentan varias características que justifican su uso como PS, tales como su accesibilidad sintética, altos coeficientes de absorción molar y altos rendimientos cuánticos del estado triplete, de fluorescencia y de generación de 1O2. No obstante, hasta ahora las SubPcs han sido exploradas sobre todo para su aplicación en dispositivos fotovoltaicos y materiales ópticos no lineales, mientras que su uso en aplicaciones biomédicas permanece poco estudiado. Por otro lado, una nueva tendencia en el desarrollo de PS son los PS de tercera generación, es decir PS conjugados covalentemente, o de modo no covalente, con agentes transportadores para su liberación y acumulación especifica dentro de los tejidos diana, o nanoestructuras biohíbridas que optimizan su solubilidad en medio acuoso, rompen la agregación y proporcionan una elevada biocompatibilidad. Con el objetivo de extender el conocimiento sobre las propiedades y la eficacia in vitro de las SiPcs y SubPcs como PS, en esta tesis hemos preparado varios derivados de ambos, sustituidos con una gran variedad de sustituyentes en las posiciones axiales, y presentando o no cargas positivas en la periferia. Además, algunos de esos PS han sido conjugados con agentes transportadores o nanovehículos en sistemas biohíbridos que mejoran su distribución y liberación en los tejidos diana. Finalmente, se ha investigado la eficacia in vitro de los PS obtenidos, tanto para PDT como para PDI. Así, esta tesis se encuentra dividida en tres grandes capítulos. 6 Resumen y Conclusiones Capítulo 1: Diseño, síntesis y evaluación in vitro de fotosensibilizadores neutros para su uso en terapia fotodinámica En el Capítulo 1 se describe la síntesis de nuevos derivados de SiPcs y SubPcs para su aplicación en PDT, más específicamente en el tratamiento de enfermedades oncológicas.  En el Subcapítulo 1, se ha sintetizado una serie de SiPcs que presentan una variedad de sustituyentes con diferentes características, tanto de manera simétrica como asimétrica. En concreto, los sustituyentes axiales que han sido introducidos tienen la capacidad de inhibir el estado excitado de la SiPc, y como consecuencia su generación de 1O2 y su fluorescencia. Por un lado, se han empleado sustituyentes portadores de grupos pireno, que actuarán como grupos dadores en un proceso de transferencia electrónica de energía (EET: electronic energy transfer) en la cual la SiPc actúa como aceptor. Por otro lado, se ha empleado un sustituyente con un grupo amino (6), que participará en un fenómeno de transferencia de electrones fotoinducida (PET: photoinduced electron transfer). Para todas las SiPcs sintetizadas (SiPc 1-3), tanto su rendimiento cuántico de 1O2 (φΔ) como de fluorescencia (φF680) han sido evaluados y comparados con los rendimientos cuánticos de una SiPc de referencia desprovista de dichas unidades inhibidoras (SiPc 4), confirmando la estrategia empleada. Además, en el caso de las SiPcs portadoras de grupos pireno también la fluorescencia de los propios grupos pireno (φF377) está inhibida de manera muy eficaz, permitiendo su uso en teranóstica. En el caso de los grupos amino, la inhibición es claramente reversible; una vez protonado el grupo amino ya no puede producirse el proceso de PET, y la SiPc recupera su capacidad para generar 1O2 y su fluorescencia. En el caso de los grupos pireno, la eficacia de la EET depende de la distancia entre el dador y el aceptor. De este modo, se puede revertir la inhibición rompiendo el puente disulfuro que enlaza el pireno y la SiPc, empleando un reductor. Así, la SiPc asimétrica que presenta ambas unidades inhibidoras (SiPc 1) es la molécula con mayor interés, y su comportamiento en función de los dos parámetros que suprimen la inhibición (medio ácido y presencia de un reductor) ha sido estudiado en detalle en la Seccion 1.3. Hay que destacar que ambas vías para invertir la inhibición son particularmente relevantes para la aplicación final de este PS, ya que un medio ligeramente ácido y un ambiente reductor son dos características de las células Resumen y Conclusiones 7 tumorales. De esta manera, tanto la generación de 1O2 como la fluorescencia de la SiPc y de los grupos pirenos (F377) se activarían solo una vez dentro del tejido diana, las células tumorales, incrementando la selectividad del PS estudiado. Para algunas SiPcs seleccionadas (SiPc 1, 3 y 4), su eficacia in vitro ha sido estudiada en varias líneas de células tumorales, durante una colaboración con el laboratorio de microbiología de Ángeles Juarranz de la Fuente, en el Departamento de Biología de nuestra propia universidad. Tal y como se describe en la Sección 1.4, la SiPc 3, la más anfifílica de la serie, es la que ha dado lugar a los mejores resultados, tanto en cantidad de absorción celular como en eliminación de las células tumorales.  En el Subcapítulo 2, se ha llevado a cabo el diseño, la preparación y la caracterización de una serie de SubPcs para su uso como PS en PDT. Tanto los rendimientos cuánticos de fluorescencia (φF571 y φF377) como de generación de 1O2 (φΔ) de todas las SubPcs de esa serie han sido determinados, indicando que en este caso la inhibición de F377 causada por EET entre los pirenos y la SubPc es muy efectiva, EET quenching PET quenching 1O2 Fluorescence at 377 nm Fluorescence at 680 nm DTT H+ hν 1 INPUTS OUTPUTS 8 Resumen y Conclusiones más que en el caso de las SiPcs, lo cual permite el uso de estas SubPcs (15 y 16) en diagnóstica. Por otro lado, aunque la inhibición de la fluorescencia de la SubPc (F571) y de la generación de 1O2 (φΔ) no es tan efectiva, toda la serie de SubPcs resulta interesante para su uso como PS en PDT, ya que los valores de φΔ son muy altos y prometedores. En consecuencia, la eficacia de esos compuesto in vitro se está estudiando en el laboratorio de Ángeles Juarranz, y se espera obtener los primeros resultados próximamente.  En el Subcapítulo 3, se han combinado los dos PS usados en las secciones anteriores en una sola molécula. En concreto, se ha sintetizado una tríada compuesta por una SiPc portadora de dos SubPcs en sus posiciones axiales. Su generación de 1O2 y su fluorescencia han sido diseñadas para ser sensibles al ambiente de las células tumorales, de manera similar al caso de las SiPc del Subcapítulo 1. Con la intención de mejorar la eficacia del proceso de inhibición por EET, se han elegido las SubPcs como unidades dadoras en vez de los grupos pirenos, ya que su espectro de emisión solapa con la banda Q de la SiPc, en vez de con la banda Soret, lo cual ha resultado en una inhibición de su estado singlete excitado más eficaz, tal como se ha estudiado en la Sección 3.3. Además, hay que destacar que las SubPcs absorben en regiones de baja absorción de las SiPcs, por lo cual la conjugación de ambos macrociclos permite obtener una fotosensibilización pancromática que en principio debe maximizar la generación de 1O2. No obstante, la estabilidad de la triada ha resultado ser baja, por lo cual no se han podido llevar a cabo estudios de su eficacia in vitro. EET quenching1O2tumor cell1O2hνGHSGHSGHSGHSa)b) Resumen y Conclusiones 9 Capítulo 2: Diseño, síntesis y evaluación in vitro de fotosensibilizadores catiónicos para su uso en la inactivación fotodinámica de microorganismos En el Capítulo 2, se describe la síntesis de nuevos derivados de SiPcs y SubPcs catiónicas, para su aplicación en PDI. Para su uso en PDI, es favorable que los PS estén cargados positivamente, ya que la inactivación de microorganismos está basada en causar daño a la membrana citoplasmática de los microorganismos, la cual suele estar cargada negativamente. De esta manera, los PS catiónicos son en principio capaces de inactivar una gran variedad de microorganismos, tales como hongos, levaduras, protozoos parásitos, bacterias Grampositivas e incluso bacterias Gram-negativas. Estas últimas son, debido a la presencia de una segunda membrana celular, las especias más difíciles de inactivar, e imposibles de inactivar con PS neutros o cargados negativamente. Aparte de ser catiónicos, los PS deben demostrar las características generales requeridas para PDT, tales como coeficientes de absorción altos en la zona del infrarrojo cercano (NIR: near infrared) y altos rendimientos cuánticos de formación del estado triplete y generación de 1O2.  Con esto en mente, en el Subcapítulo 1 de este capítulo se ha sintetizado una serie de SiPcs catiónicas. En paralelo a la serie de SiPcs neutras descrita en el Capítulo 1, se ha introducido una variedad de sustituyentes axiales, mientras que la periferia de las SiPcs presenta invariablemente ocho grupos de tipo piridinio, resultando en una serie de SiPcs octacatiónicas. La influencia del ligando axial ha sido evaluada en detalle, determinando el estado de agregación y los rendimientos cuánticos de fluorescencia y 1O2 para toda la serie. Además, se ha valorado la eficiencia de la inactivación de los PS frente a S. aureus, una bacteria Gram-positiva, y Methicillin-resistant S. aureus, una variante más resistente a varios tipos de antibióticos. En ambos casos, la SiPc 30, desprovista de toxicidad en 10 Resumen y Conclusiones oscuridad y con niveles de inactivación de los microorganismos de hasta el 99,99%, ha dado los mejores resultados.  En el Subcapítulo 2, por otro lado, se ha expuesto la idea de sintetizar una serie de SubPcs hexacatiónicas, para el mismo fin. Sin embargo, tras sintetizar el derivado clorado de la SubPc hexacatiónica, con seis grupos piridinio en la periferia, ha quedado claro que este tipo de SubPc es inestable y su uso como PS en PDT ha sido descartado. Resumen y Conclusiones 11 Capítulo 3: Diseño, síntesis y evaluación in vitro de sistemas fotosensibilizadores biohíbridos para su uso en terapia fotodinámica y/o la inactivación fotodinámica de microorganismos El Capítulo 3 se ha dedicado a la preparación de diferentes materiales biohíbridos, para su aplicación en PDT y/o PDI, mediante la combinación de un PS con dos biomoléculas diferentes. Estas biomoléculas han sido seleccionadas cuidadosamente, con el objetivo de mantener o incluso mejorar las características de los PS, mediante desagregación de los mismos en medios acuosos, además de resultar en materiales biocompatibles y monodispersos que dan lugar a sistemas fotoactivos nanoestructurados.  En el Subcapítulo 1 se describe la conjugación de una SiPc y una SubPc con un péptido de penetración celular (CPP: cell penetrating peptide). La conjugación y subsiguiente caracterización han sido llevadas a cabo durante una estancia predoctoral en el laboratorio de Annemieke Madder en la Universidad de Gante (Bélgica). Para este fin, se han sintetizado previamente una una SiPc (42) y SubPc (43) portadoras de un sustituyente con un grupo maleimida en la posición axial. La elección de este grupo funcional se basa en que puede reaccionar de manera sencilla y eficaz con una unidad de cisteína, presente en el péptido, mediante una reacción tiol-eno de tipo “click”. Los biohíbridos resultantes (37 y 38) son totalmente solubles en agua, y sus propiedades fotofísicas, tales como su fluorescencia y generación de 1O2, han sido examinadas tanto en agua como en tampón fosfato salino (PBS: phosphate buffered saline), un medio representativo desde el punto de vista biológico. Su elevada tendencia a la internalización ha sido confirmada por análisis de citometría de flujo (FACS, fluorescence activated cell sorting) en el laboratorio de Bruno de Geest, también en la Universidad de Gante, confirmando la utilidad de esta estrategia. Queda pendiente la visualización de la absorción celular por microscopía de fluorescencia confocal. Estos PS biohíbridos podrían ser utilizados tanto en el tratamiento de enfermedades oncológicas (PDT) como en la inactivación fotodinámica de microorganismos (PDI). 12 Resumen y Conclusiones  En el Subcapítulo 2 se describe la preparación y caracterización de complejos supramoleculares de ftalocianinas de zinc (ZnPcs) catiónicas y nanocristales de celulosa (CNCs, cellulose nanocrystals), como una nueva clase de PS nanoestructurados para la fotogeneración de 1O2. Este trabajo sigue una estrategia basada en la inmovilización mediante interacciones electrostáticas entre derivados catiónicos de ZnPc (44 y 45) y la superficie no modificada de los CNCs, que presentan grupos sulfónicos como consecuencia de su síntesis. Los híbridos resultantes han sido caracterizados mediante diversas técnicas, demostrando que no solo la agregación de la ZnPc, sino también la tendencia a la agregación de los CNCs juegan un papel clave en la producción de 1O2. Las propiedades fotofísicas de estos compuestos, junto con su eficacia in vitro frente a una serie de microorganismos, han sido estudiadas en detalle durante una estancia predoctoral en los laboratorios de Santi Nonell Marrugat y Montserrat Agut Bonsfills en el Institut Químic de Sarrià de la Universitat Ramon Llull (Barcelona), tal y como se describe en las Secciones 2.3 y 2.4. En consecuencia, la inactivación fotodinámica de microorganismos por 44-CNC y 45-CNC muestra mejoras evidentes en comparación con la inactivación causada por las ZnPcs libres. Además, es importante destacar que los sistemas 44-CNC y 45-CNC demuestran una eficacia significativamente mayor que otros sistemas biohíbridos previamente mencionados en la literatura, en los cuales el PS se ha unido covalentemente a la superficie de los CNC. En este sentido, los biohíbridos desarollados en esta Sección han demostrado ser biomateriales fotoactivos muy prometedores, que pueden encontrar aplicaciones útiles en biomedicina y nanotecnología. Repulsiónelectrostática