Análisis funcional de la familia de fosfatasas de tipo 2c en saccharomyces cerevisiae

Resumen

La familia de proteína fosfatasas de tipo 2C (PP2C) comprende un grupo de enzimas monoméricas que se encuentra conservado a lo largo de la evolución. A diferencia de otras fosfatasas, cuya especificidad se fundamenta en la interacción entre unas pocas subunidades catalíticas y numerosas subunidades reguladoras, las PP2C carecen, aparentemente, de subunidades reguladoras. Los organismos eucariotas poseen múltiples genes que codifican PP2C. Incluso un organismo relativamente simple, como la levadura Saccharomyces cerevisiae, contiene siete genes PP2C en su genoma (PTC1-7). Mientras que Ptc1-4 poseen una localización citoplasmática o nuclear en algún caso, Ptc5-7 se hallan en la mitocondria. El principal papel conocido de algunas de estas proteínas consiste en regular negativamente la vía de señalización inducible por estrés osmótico, denominada vía HOG, desfosforilando e inactivando la MAP quinasa Hog1. No obstante, nuestro conocimiento acerca de las funciones específicas y de la regulación de cada isoforma es aún bastante limitado. Con el objetivo de realizar un estudio más amplio que permitiese identificar funciones específicas para cada isoforma, decidimos analizar los perfiles transcripcionales de los mutantes ptc1, 2, 3, 4 y 5 en condiciones estándar de cultivo. Se han obtenido dos patrones de expresión claramente diferenciados: el producido por la falta de Ptc1 y el resultante de la ausencia de Ptc2-5. En el mutante ptc1 se encuentra aumentada la expresión de varios genes normalmente inducidos por situaciones de daño en la pared celular sugiriendo que la falta de Ptc1 induce la activación de la vía de señalización responsable del control de la integridad celular. Hemos determinado que los fenotipos resultantes de la deleción de PTC1 no son exclusivamente atribuibles a una hiperactivación de la vía de señalización de la MAP quinasa Slt2 y que la MAP quinasa Hog1 no está aparentemente relacionada con ellos. Asimismo demostramos que células carentes de Ptc1 presentan una hiperactivación de la fosfatasa calcineurina, son sensibles a calcio, a metales como el zinc o el cobre, a pH alcalino y muestran un patrón de gemación alterado. Cabe destacar que muchos de estos fenotipos son también característicos de mutantes con alteraciones en la función vacuolar. Además, las vacuolas del mutante ptc1 están fragmentadas. Estos resultados dan soporte a la hipótesis de que muchos de los defectos de una cepa ptc1 son el resultado de una alteración vacuolar primaria y demuestran que las funciones que desempeña Ptc1 no son compartidas por otros miembros de la familia Ptc. Un segundo bloque de resultados se fundamenta en torno al hallazgo de un nuevo fenotipo ligado a la ausencia de PTC1: la sensibilidad a cloruro de litio. Las células ptc1 son menos eficaces expulsando cationes litio y acumulan una mayor concentración de este catión. Todo ello podría ser consecuencia de que la actividad del promotor de ENA1 (gen que codifica el principal detoxificador de cationes sodio y litio presente en la membrana plasmática) se encuentra disminuida en un mutante ptc1. La deleción de PTC1 en una cepa defectiva en Hal3 no agrava el fenotipo halosensible de este mutante ni incrementa la sensibilidad a litio de cepas que carecen de la fosfatasa calcineurina y de los transportadores de potasio Trk1 y Trk2. Estos resultados nos han permitido postular que Ptc1 modula la función de la ATPasa Ena1 a través de la vía Hal3/Ppz1,2. Por último, demostramos que Ptc1 es necesaria para el correcto funcionamiento de la vía TOR, la cual desempeña un papel clave en la señalización por nutrientes. En este trabajo determinamos que la falta de Ptc1 atenúa la señalización a través de la vía, afectando prácticamente a cualquiera de las dianas conocidas, como la expresión de genes ribosomales o la entrada al núcleo de los factores de transcripción Gln3 y Msn2. La estructura de la vía TOR en S. cerevisiae es intrincada y dista de estar definida por completo. No obstante, los análisis de epistasis ponen en evidencia que Ptc1 tiene un papel regulando la vía a nivel de Sit4 o de Tip41. De hecho, el mutante ptc1, aún sin tener disminuida la expresión del gen TIP41, posee unos niveles anormalmente bajos de esta proteína, lo que impide la correcta interacción entre Tip41 y Tap42, un evento clave en la transmisión de la señal a través de la vía TOR. Asimismo, hemos determinado que en las células carentes de Ptc1 la estabilidad de la proteína Tip41 disminuye claramente y que ello podría estar provocado por la alteración en el patrón de fosforilación de Tip41. Se trata, por tanto, de la primera ocasión en la que una fosfatasa de tipo 2C es relacionada con la vía TOR.