Evolution of the ramalina decipiens group (lichenized ascomycota) in macaronesiacomparative study of its symbionts and ecophysiological traits

Resumen

ANTECEDENTES Las islas oceánicas son aquellas que, debido a su origen volcánico, nunca han estado conectadas con los continentes. Estas islas han atraído el interés de los científicos desde el siglo XIX, utilizándolas como laboratorios naturales en los que estudiar el origen de la biodiversidad y su evolución (Whittaker & Fernández-Palacios 2007; Warren et al. 2015). Quizás el fenómeno evolutivo mejor estudiado en las islas oceánicas ha sido el de las radiaciones evolutivas. Hay muchos tipos de radiaciones evolutivas y otros procesos que han sido tradicionalmente incluidos dentro de este término: disparificaciones, pseudorradiaciones, radiaciones geográficas, radiaciones climáticas, sistemas de coevolución, radiaciones exaptativas y radiaciones adaptativas (revisado en Simões et al. 2016). Entre ellas, las radiaciones adaptativas son las que han atraído más atención. Los ejemplos mejor estudiados de radiaciones adaptativas se han centrado en organismos bandera como los pinzones de las Islas Galápagos (Grant & Grant 2008), la alianza de las espadas de plata de Hawái (Landis et al. 2018) o los lagartos Anolis de las Grandes Antillas (Losos 2009). También se han detectado posibles radiaciones en taxones menos estudiados (por ejemplo, Parent & Crespi 2009; Simon et al. 2018), pero rara vez se ha estudiado su carácter adaptativo. Los líquenes son el ejemplo paradigmático simbiosis mutualista. Tradicionalmente se han definido como compuestos por un socio fúngico, el micobionte, y uno o más socios fotosintéticos, los fotobiontes (Nash III 2008), pero el concepto se ha ampliado recientemente (Hawksworth & Grube 2020; Lücking et al. 2021; Spribille et al. 2022) para dar cabida a los integrantes de los microbiomas bacterianos y fúngicos, cuyo papel dentro del talo liquénico se ha demostrado esencial (Grimm et al. 2021). Los hongos liquenizados tienen, en general, amplios rangos de distribución (Galloway 2008), y se conocen escasos casos de radiaciones insulares en hongos liquenizados: los géneros Nephroma en Macaronesia (Sérusiaux et al. 2011), Sticta en Madagascar y las Mascareñas (Simon et al. 2018) y la microrradiación de Lobariella en Hawái (Lücking et al. 2017b). Sin embargo, el ejemplo más notable tal vez sea el género Ramalina en Macaronesia. Ramalina es uno de los géneros de hongos liquenizados más diversos (c. 230 especies, Lücking et al. 2017a). Tiene una distribución subcosmopolita, pero cinco zonas destacan por su alta diversidad: Baja California (Ryan et al. 2004), África Oriental (Krog & Swinscow 1976), Australasia (Stevens 1987; Blanchon et al. 1996), Los Andes (Marcano et al. 2021) y Macaronesia (Krog & Østhagen 1980a, b; Krog 1990). Macaronesia es una región biogeográfica formada por cinco archipiélagos volcánicos en el Atlántico; Azores, Madeira, Selvagens, Islas Canarias y Cabo Verde, así como por una franja de tierra en África occidental conocida como el enclave macaronésico (Fernández-Palacios et al. 2011). Estudios recientes han mostrado que ha habido un número limitado de eventos de colonización independientes de los archipiélagos por taxones del género Ramalina, y que uno de estos eventos de colonización desencadenó una radiación excepcional (la "Gran Radiación Macaronésica", Pérez-Ortega et al. in prep.) que incluye la mayoría de las especies endémicas, así como algunos taxones mediterráneos no conocidos actualmente en las islas. Dentro de la Gran Radiación Macaronésica se anidan dos radiaciones paralelas más pequeñas, que se corresponden con los grupos R. decipiens y R. bourgaeana. Estos dos grupos han colonizado el medio saxícola de manera independiente. El grupo Ramalina decipiens está formado por cinco especies endémicas de Macaronesia: R. decipiens Mont., R. erosa Krog, R. hamulosa Krog & Østh., R. maderensis Motyka y R. portosantana Krog. La distribución de las especies varía enormemente. La mayoría de las especies están restringidas a un único archipiélago, pero R. decipiens y R. maderensis están ampliamente distribuidas. Tal y como las definieron Krog & Østhagen (1980a), estas dos especies muestran una variabilidad morfológica muy elevada, lo que se ha interpretado como fruto de un proceso de especiación actual. Los estudios sobre radiaciones evolutivas en hongos liquenizados son escasos y están limitados a la evolución de algunos grupos que presentan una gran diversidad (Kraichak et al. 2015b; Gaya et al. 2015; Nelsen et al. 2021). Actualmente no existe ningún trabajo que estudie los factores que originan radiaciones en hongos liquenizados en islas. En base a su carácter endémico ligado a la región macaronésica, proponemos el grupo R. decipiens como un sistema modelo para el estudio de este proceso en hongos liquenizados en islas oceánicas. OBJETIVOS El objetivo principal de esta tesis doctoral es identificar los factores que han causado la radiación del grupo Ramalina decipiens, explorando su carácter adaptativo. Para ello proponemos los siguientes objetivos específicos: (1) reevaluar la taxonomía del grupo y reconstruir las relaciones filogenéticas entre sus especies, (2) explorar el posible papel de una segregación del nicho trófico en la radiación, (3) estudiar el papel potencial de las comunidades bacterianas asociadas a las especies del grupo en su radiación y (4) explorar el posible papel de una segregación del nicho abiótico en la radiación. METODOLOGÍA La presente memoria doctoral se estructura en cinco capítulos en los que se abordan los objetivos específicos. En el primer capítulo se pretende realizar una delimitación de especies siguiendo un enfoque de taxonomía integradora y resolver la filogenia del grupo R. decipiens. Construimos una hipótesis filogenética basada en seis marcadores moleculares, cuatro de los cuales se desarrollan específicamente para este fin, y utilizamos seis fuentes de información para generar varias hipótesis de especies: (1) estrategias de descubrimiento de especies basadas en un solo locus, (2) clustering genético jerárquico, (3) caracterización morfológica, (4) caracterización química, (5) origen geográfico y (6) algoritmos de clustering no supervisados para analizar los datos morfológicos, químicos y geográficos. Estos análisis se realizaron sobre 306 especímenes. En el segundo capítulo exploramos el papel del nicho trófico (los fotobiontes) en la radiación del grupo R. decipiens. La diversidad de los fotobiontes se estudió mediante secuenciación masiva (Illumina MiSeq) de la región ITS2 de 197 especímenes representativos de la distribución total de todas las especies del grupo. En el tercer capítulo caracterizamos la fisiología de los dos fotobiontes más abundantes identificados en el capítulo anterior. Para ello se establecieron cultivos axénicos de ambos fotobiontes que utilizamos para explorar su desempeño bajo diferentes tratamientos de temperatura e intensidad de luz, estudiar varios parámetros de la fluorescencia de las clorofilas y cuantificar sus pigmentos fotosintéticos. Además, caracterizamos la ultraestructura de ambas cepas mediante microscopía electrónica de transmisión. En el cuarto capítulo exploramos el papel de las comunidades bacterianas asociadas a las distintas especies del grupo en la radiación. La diversidad bacteriana se estudió mediante secuenciación masiva (Illumina MiSeq) de la región hipervariable V1-V2 de 172 especímenes recolectados en los archipiélagos en los que aparecen las especies. En el quinto capítulo exploramos la posibilidad de que el motor de la radiación fuese la segregación del nicho abiótico. Para ello caracterizamos las estrategias ecofisiológicas de las distintas especies del grupo respecto a la captación y retención de agua, evaluamos si existen diferencias entre especies y si los distintos rasgos estudiados están relacionados con las variables ambientales. RESULTADOS En el primer capítulo empleamos un enfoque integrador basado en la generación automática de diferentes hipótesis de especies que posteriormente se compararían mediante factores de Bayes (Grummer et al. 2014). Sin embargo, encontramos una serie de dificultades que nos impidieron seguir este flujo de trabajo. La principal fue el hecho de que las hipótesis de especies basadas en datos moleculares de un solo locus devolvían un número biológicamente irreal de especies candidatas, mientras que los algoritmos de clustering no supervisado de datos fenotípicos y geográficos proponían especies candidatas no monofiléticas. Además, los análisis *BEAST mostraron problemas de convergencia en la mayoría de los parámetros estimados, por lo que no se pudo realizar el cálculo de los factores de Bayes. Atribuimos estas dificultades al hecho de que el grupo R. decipiens es una radiación reciente, un tipo de sistema en el que una correcta delimitación de especies es notablemente difícil de realizar (Losos 2009; Zink & Vázquez-Miranda 2019; Jorna et al. 2021). Como solución de compromiso, basamos la delimitación de especies en los clados soportados del árbol filogenético que mostraban caracteres diagnósticos (morfológicos, químicos y/o geográficos). Siguiendo este enfoque, elevamos el número de linajes a nivel de especie en el grupo R. decipiens a quince. Descubrimos además que dos especies, R. nematodes y R. pluviariae, que debido a importantes diferencias anatómicas se creía que pertenecían a otra región de la filogenia de Ramalina, formaban parte del grupo R. decipiens. En total, descubrimos ocho linajes a nivel de especie no reconocidos anteriormente, seis de los cuales se describirán como nuevas especies. Por último, pudimos reconstruir las relaciones filogenéticas entre las especies del grupo con un apoyo casi total, proporcionando un marco filogenético en el que integrar los datos generados en los estudios posteriores. En el capítulo dos exploramos la posibilidad de que una segregación del nicho trófico (fotobiontes asociados a cada especie) fuera el principal impulsor de la radiación del grupo R. decipiens, pero no encontramos pruebas que apoyasen esta hipótesis. Como hongos liquenizados, el nicho trófico de las especies del grupo R. decipiens puede entenderse como la identidad y abundancia de sus fotobiontes. Descubrimos que el grupo R. decipiens forma asociaciones con 66 haplotipos de Trebouxia pertenecientes a trece linajes a nivel de especie, que aparecieron a lo largo de los cuatro principales clados del género. La mitad de estos haplotipos pertenecían a Trebouxia sp. TR9, recientemente descrita como T. lynnae (Barreno et al. 2022), y dos de ellos actuaban como fotobionte principal en la mayoría de los talos, independientemente de la especie de Ramalina a la que pertenecieran. Nuestros resultados también mostraron que la coexistencia de algas se da en casi todas las especies del grupo, pero su relevancia ecológica y evolutiva es probablemente baja, ya que el fotobionte principal representó c. 95% de los “reads” en la mayoría de los talos. El principal factor para explicar la estructura de las comunidades de fotobiontes fue el efecto combinado de la isla en la que se recolectó el espécimen y las condiciones macroclimáticas de la localidad de muestreo, mientras que la especie de micobionte tuvo una importancia menor. Estos resultados sugieren que las especies del grupo R. decipiens se asocian con fotobiontes adaptados a las condiciones locales. Esto es particularmente claro en los especímenes de R. maderensis recolectados en Cabo Verde, que en lugar de las dos cepas de T. lynnae se asocian principalmente con Trebouxia C25, una especie no descrita que hasta ahora sólo se había encontrado en Kenia (Muggia et al. 2020). La clara dominancia de las dos cepas de T. lynnae, junto al hecho de que una de ellas sólo ha sido citada en Macaronesia y el sur de España, mientras que la otra también se ha encontrado en Polonia y Suecia, nos hicieron sospechar que podrían ser fisiológicamente diferentes a pesar de estar separadas por sólo un nucleótido. En el capítulo tres exploramos esta posibilidad. Descubrimos que ambas cepas tenían cierta plasticidad para aclimatarse a las condiciones ambientales cambiantes y, lo que es más importante, que presentaban estrategias ecofisiológicas diferentes a pesar de su gran proximidad filogenética. La cepa restringida a Macaronesia y al sur de España crecía mejor a altas temperaturas, acumulaba más xantófilas y β-carotenos y tenía una mayor tasa fotosintética, mientras que la que también estaba presente en Polonia y Suecia tenía un mejor rendimiento a bajas temperaturas, acumulaba más luteína y tenía menores ratios de clorofila a/b. Este comportamiento fisiológico diferencial recuerda a la respuesta de las plantas a la intensidad de la luz, por la que se generan "hojas de sol" en ambientes de alta luminosidad y "hojas de sombra" en los de baja luminosidad (Lichtenthaler et al. 2007; Esteban & García-Plazaola 2014). Los resultados de estos dos capítulos sugieren que no se ha producido una segregación del nicho trófico y que las especies del grupo se asocian con los fotobiontes que mejor se adaptan al entorno en el que crecen los talos, tanto a escala de macro como de micrositio. En el cuarto capítulo estudiamos la importancia en la radiación del grupo de las interacciones simbióticas con microorganismos. Llevamos a cabo este estudio porque el papel de estas interacciones en las dinámicas evolutivas podría ser especialmente relevante para los hongos liquenizados, ya que las comunidades bacterianas del talo liquénico son una parte integral de la simbiosis y están implicadas en numerosas funciones (Grimm et al. 2021). Descubrimos que las especies del grupo R. decipiens se asocian mayoritariamente con bacterias pertenecientes a la clase Alphaproteobacteria y, en menor medida, con Acidobacteria. Nuestros resultados mostraron que las diferentes especies difieren en la composición de sus comunidades bacterianas asociadas y que estas diferencias están estructuradas filogenéticamente. Sin embargo, esto parece ser el resultado de un filtrado ambiental. Existe una posible excepción, R. sampaiana, una especie endémica de Porto Santo. Esta especie tiene un microbioma “core” anormalmente diverso, que incluye bacterias pertenecientes a géneros que no aparecen en los microbiomas “core” de las otras especies. Nuestros resultados sugieren que el microbioma de esta especie puede estar sujeto a un filtro ambiental específico a nivel funcional. En el capítulo cinco exploramos la posibilidad de que una segregación del nicho abiótico fuera el principal motor de la radiación del grupo R. decipiens. Sospechamos que la existencia de diferentes estrategias para utilizar el agua podría estar detrás de la radiación del grupo porque (1) las especies de Ramalina requieren aire húmedo, y no agua líquida, para alcanzar condiciones fotosintéticas óptimas (Lange & Tenhunen 1981; Lange et al. 1989; Nash III et al. 1990), (2) las especies del grupo R. decipiens parecen estar sujetas a diferentes fuentes de aire húmedo, incluyendo los vientos alisios cargados de humedad y, (3) las especies muestran importantes diferencias morfológicas que podrían influir en su capacidad para adquirir y almacenar agua (Rundel 1982; Eriksson et al. 2018). Nuestros resultados indicaron que la partición del nicho ecológico en la radiación del grupo R. decipiens está relacionada con las diferencias en la disponibilidad y explotación del agua. Hemos encontrado que las especies del grupo ocupan un amplio espacio funcional relacionado con el agua, difieren en la hidrofobicidad de la superficie (que en las especies del grupo es un producto de la composición química del córtex), capacidad de retención de agua y en las cinéticas de desecación e hidratación por aire húmedo. Nuestros resultados muestran que parte de esta variabilidad está relacionada con las condiciones macroclimáticas en las que se encuentran las especies. Sin embargo, también sugieren que la partición del nicho podría estar teniendo lugar a escala de micrositio, lo que sería congruente con los resultados de estudios en otros líquenes (por ejemplo, Stanton 2015) y con el hecho de que diferentes especies del grupo aparecen a menudo en las mismas localidades pero con cierto nivel de segregación de micrositio. Nuestros resultados también sugieren que la oportunidad ecológica para que la radiación del grupo pudiese desarrollarse surgió, al menos en parte, de la evolución de una estructura anatómica, los cilindros de tejido condroide, que permitió a las especies sacar partido de un cambio en el régimen selectivo relacionado con la disponibilidad de agua. CONCLUSIONES Las siguientes conclusiones han sido extraídas de los resultados de los cinco capítulos de la tesis doctoral: 1. La taxonomía del grupo Ramalina decipiens ha sido difícil de resolver, incluso utilizando un enfoque integrador que incorpora análisis automáticos de delimitación de especies basados en datos tanto moleculares como morfoanatómicos. 2. Los niveles de diversidad y endemicidad en el grupo son mucho mayores de lo que se pensaba. Actualmente el grupo consta de quince linajes a nivel de especie: R. decipiens, R. delicata, R. erosa, R. fortunata, R. gomerana, R. hamulosa, R. maderensis, R. nematodes, R. papyracea, R. pluviariae, R. portosantana, R. sabinosae, R. sampaiana, R. sp. 1 y R. sp. 2. 3. No hemos obtenido ningún resultado que indique que una segregación del nicho trófico ha tenido lugar en el grupo R. decipiens. Las distintas especies están asociadas con 66 haplotipos pertenecientes a los cuatro clados del género Trebouxia. Sin embargo, en la mayoría de talos estudiados el fotobionte principal fue uno de dos haplotipos ampliamente distribuidos de T. lynnae. 4. La co-ocurrencia de varios fotobiontes ha sido observada en prácticamente todas las especies, pero en la mayoría de talos el 95% de los “reads” pertenecían al fotobionte principal. Este fenómeno es posiblemente de poca importancia ecológica y evolutiva en el grupo. 5. A pesar de su gran proximidad filogenética, los dos fotobiontes más comunes del grupo muestran diferencias en el contenido de carotenoides, ratio clorofila a/b y en su desempeño fotosintético bajo diferentes tratamientos de temperatura e intensidad de luz. Estas diferencias son similares a las observadas entre las hojas de sol y de sombra en plantas vasculares. 6. Las especies del grupo R. decipiens se asocian con fotobiontes adaptados a las condiciones locales, tanto a una escala de macrohábitat como, probablemente, de microhábitat. Esto es especialmente observable en los ejemplares de R. maderensis recolectados en Cabo Verde. 7. Se descarta en su mayoría un papel relevante de la microbiota asociada al grupo R. decipiens en su diversificación, con la posible excepción de una especie, R. sampaiana, que alberga un microbioma "core" anormalmente diverso y cuyas comunidades bacterianas parecen estar sometidas a un filtro a nivel funcional. 8. Las comunidades bacterianas asociadas al grupo R. decipiens incluían bacterias pertenecientes a 20 clases diferentes, de las cuales las más comunes eran las Alfaproteobacterias y las Acidobacterias. 9. Las comunidades bacterianas asociadas a las especies del grupo son diferentes y están filogenéticamente estructuradas, pero esto parece ser el resultado de un filtrado ambiental, quizá relacionado con las diferencias en la disponibilidad de agua a escala de micrositio. 10. La hidrofobicidad superficial en el grupo R. decipiens es un producto de la composición química del córtex de los talos. 11. Las especies del grupo R. decipiens ocuparon diferentes regiones del espacio funcional creado a partir de rasgos relacionados con la captación y retención del agua. Parte de esta variabilidad estaba relacionada con las condiciones macroclimáticas en las que se encuentran las especies, lo que sugiere un importante papel de la ecofisiología en la radiación del grupo, a diferencia de los otros posibles impulsores que se exploraron anteriormente. 12. Sólo dos de las variables ecofisiológicas que eran diferentes entre especies estaban filogenéticamente conservadas: las cinéticas de hidratación y desecación. Además, el modelo de evolución que mejor se ajustaba a ellas era el de "Brownian motion" y no el de "early burst". 13. Las especies del grupo R. decipiens pueden haberse diversificado desarrollando diferentes estrategias ecofisiológicas de captación y retención de agua. Esto habría ocurrido bajo un cambio de régimen selectivo causado por la aridificación del clima y la aparición de una nueva fuente de agua: los vientos alisios cargados de humedad. La radiación del grupo R. decipiens habría sido provocada por los cilindros condroides, que permitieron al grupo explotar los diferentes nichos disponibles bajo las nuevas condiciones climáticas. 14. La radiación del grupo R. decipiens aparentemente se desarrolló en primer lugar por una diversificación relacionada con el cambio de sustrato, de corteza a roca, y una diversificación posterior para aprovechar diferentes micronichos relacionados con el agua.