Estudio de factores que puedan regular la actividad antiviral de HDAC6, y efecto sobre la capacidad proviral del complejo de envoltura de virus primarios de pacientes VIH+

Resumen

El VIH/SIDA sigue siendo una amenaza global, a pesar de los notables esfuerzos realizados por las comunidades científica y sanitaria para comprender la infección viral, el diseño de nuevos fármacos o la mejora de los existentes, así como del desarrollo de terapias avanzadas y diseño de potenciales vacunas para lograr la cura funcional y la erradicación viral. La identificación y el análisis de individuos VIH-1 positivos que controlan naturalmente la replicación viral, en ausencia de tratamiento antirretroviral, ha brindado pistas sobre los procesos celulares que pueden regular las proteínas y el ARN del virus, y que condicionan los procesos de replicación viral y de progresión clínica de la infección, así como la patología asociada. En la presente tesis doctoral, el principal objetivo de estudio se ha centrado en la proteína de unión al ADN de respuesta transactiva (TAR) 43 (“transactive response DNA-binding protein” (TARDBP o TDP-43)) la cual es reguladora importante del ARNm y, entre otros factores, de la enzima con actividad anti-VIH- 1, histona desacetilasa 6 (HDAC6). La sobreexpresión del constructo funcional parenteral de TDP-43 estabiliza los niveles de ARNm y de proteína de HDAC6, garantizando así sus funciones antivirales en células diana para la infección, afectando a la formación del poro de fusión e inhibiendo la infección por VIH-1, gracias a la actividad desacetiladora de microtúbulos (MT) de la enzima HDAC6, que actúa de forma independiente al tropismo del complejo de envoltura del virus. La regulación de la permisividad celular frente a la infección por VIH-1 por el eje TDP-43/HDAC6, se corrobora por silenciamiento específico del ARNm de TDP-43, teniendo como consecuencia la disminución en los niveles tanto del ARNm como de la proteína de HDAC6, lo que genera un estatus celular de estabilización de MT que favorece la formación del poro de fusión y la infección del VIH-1, tras el contacto de la Env con el receptor CD4, debido a la reorganización de los MT y su modificación postraduccional por acetilación (por los niveles bajos de HDAC6). Además, y considerando que la Env del VIH-1 es un determinante citopático importante en la infección y replicación viral, y para determinar la funcionalidad viral de Env de virus primarios procedentes de pacientes VIH-1 positivos con fenotipos extremos, se caracterizaron varias Env provenientes de pacientes virémicos no progresores (VNP) o rápidos progresores (RP). Para ello, se realizó un análisis exhaustivo sobre distintos parámetros funcionales de la Env, observándose que los clones de Env, seleccionadas de ambos grupos de pacientes, mostraron capacidades similares de expresión, una afinidad similar por CD4, puesta de manifiesto en ensayos de transmisión de material viral célula-célula y de señalización por CD4 (medidos por acetilación de la subunidad α-tubulina de los MT), que rigen la capacidad de fusión de membrana (formación del poro de fusión) y de infección, siendo similares en estas Env funcionales. Además, las Env de los dos grupos inducen autofagia tardía por contacto con CD4 en células no infectadas, característica que correlaciona directamente con la actividad fusogénica de las Env. En el caso de los pacientes VNP, no se observa una relación entre la función autofágica tardía letal de las Env virales con la progresión de la enfermedad, si bien los clones de Env de individuos VNP son completamente funcionales y explicaría la viremia en estos pacientes. Todo apunta a que en pacientes VNP el estatus inmunitario aporta cierta estabilidad al fenotipo clínico no progresor. Como prueba de concepto, estas observaciones se confirmaron mediante el estudio de Env virales primarias de individuos infectados por VIH-1 con diferentes fenotipos clínicos, bajo las condiciones experimentales de sobreexpresión de TDP-43. Un aumento en el nivel de expresión de la proteína funcional de TDP-43 redujo fuertemente la actividad de infección de Env de individuos VNP y RP infectados por VIH-1 hasta los niveles de infección detectado para Env provenientes de pacientes controladores de élite, no progresores a largo plazo (LTNP-EC), cuya función viral es deficiente. Por el contrario, niveles bajos de TDP-43 endógeno, inducidos por silenciamiento específico mediante oligonucleótidos interferentes siRNA-TDP-43, favorecen significativamente la actividad de infección de Env primarias de VIH-1 de individuos VNP y RP. Sorprendentemente, el silenciamiento de TDP-43, que reduce los niveles de HDAC6 (su ARNm y proteína), generando un estado celular más permisivo a la infección, permite incluso la infección eficaz celular con pseudovirus portando Env primarias, deficientes en la función viral, de individuos LTNP-EC. Del mismo modo, se estudia cómo TDP-43 ejerce un efecto regulador sobre HDAC6 en células productoras de viriones, al garantizar, mediante la estabilización en los niveles de ARN mensajero (ARNm) y proteína, las funciones autofágicas degradativas de la enzima desacetilasa. Debido a ello, los niveles de proteínas virales Pr55Gag y Vif se ven reducidos, afectando así a la replicación, producción de viriones e infectividad de los mismos. Tras el silenciamiento de TDP-43, se comprueba cómo la actividad autofágica dependiente de HDAC6 se ve reducida, aumentando así la producción viral y la infectividad de los virus generados bajo estas condiciones experimentales, evidenciando la capacidad reguladora de TDP-43 sobre HDAC6 y, consecuentemente, sus actividades antivirales.