Relaxasas conjugativas de la familia MOBv

  1. María Cristina Fernández López
Supervised by:
  1. Fabián Lorenzo Díaz Director
  2. Manuel Espinosa Padrón Director

Defence university: Universidad Complutense de Madrid

Year of defence: 2015

Committee:
  1. Julián Perera González Chair
  2. Bruno González Zorn Secretary
  3. Elisabeth Grohmann Committee member
  4. Ramón Díaz Oreja Committee member
  5. MIREN ITZIAR ALCORTA CALVO Committee member

Type: Thesis

Abstract

La conjugación bacteriana consiste en el intercambio de material genético entre dos células a través de contacto físico, por lo que supone un factor fundamental en la dispersión de resistencias a antibióticos y factores de virulencia entre bacterias. La transferencia conjugativa está mediada por tres módulos especializados: el relaxosoma (MOB), formado por la proteína relaxasa y otras proteínas que preparan el DNA en el origen de transferencia (oriT) para ser transferido; la proteína acopladora (T4CP) y el sistema de secreción de tipo IV (T4SS). Atendiendo al relaxosoma, los elementos clave para la transferencia del DNA son la relaxasa y el oriT. Las relaxasas son proteínas con actividad endonucleasa/topoisomerasa que reconocen la secuencia del oriT, sobre el que realizan un corte específico para iniciar la conjugación (célula donadora), o una transferencia de cadenas para el cierre en la terminación (célula receptora). Ambos procesos se realizan a través de transesterificaciones catalizadas por residuos de tirosina y mediante un mecanismo que comparte similitudes con la replicación por círculo rodante (RCR). Las secuencias de las relaxasas han permitido realizar una clasificación de elementos conjugativos (familias MOB) que aporta una visión global sobre la diseminación de estos elementos mediante conjugación. En concreto, los elementos de la familia MOBV se encuentran ampliamente distribuidos en bacterias G+, donde los mecanismos que dirigen la conjugación están todavía poco estudiados. Por ello, este trabajo se ha centrado en la caracterización molecular de dos elementos que codifican relaxasas MOBV: el plásmido pMV158 y el elemento integrado IMErpsI. En el primer capítulo se realizó una búsqueda bioinformática de plásmidos de la familia MOBV1 (usando su relaxasa prototipo, MobMpMV158) con la que se identificaron 97 relaxasas en 93 plásmidos. Todos estos plásmidos son movilizables y aislados de bacterias G+, principalmente del phylum Firmicutes. Aproximadamente la mitad contienen genes involucrados en resistencia a antibióticos u otros marcadores. En el segundo capítulo se abordó la caracterización del dominio relaxasa de la proteína MobM. Para ello se purificó y caracterizó una versión truncada N-terminal de MobM que contiene su dominio relaxasa. Este estudio mostró que el dominio de unión y corte de MobM sobre el DNA se localiza en los primeros 200 residuos, mientras que la región central (200-243) es importante para el posicionamiento del DNA en el centro activo. Las estructuras cristalinas de MobM con su DNA sustrato y los ensayos funcionales con mutantes desvelaron que el residuo catalítico de MobM es una histidina (H22). En el tercer capítulo se estudian las interacciones globales de MobM con DNA el plásmido pMV158. Mediante microscopía electrónica se descubrió que MobM reconoce una región de pMV158 localizada dentro del módulo de replicación-control del plásmido. En concreto, en el promotor del gen del RNAII, implicado en el circuito de control de copias del plásmido. Ensayos de EMSA y footprinting confirmaron que MobM se une específicamente a esta secuencia in vitro. Además, a través de experimentos in vivo se muestra que MobM tiene un efecto inhibidor sobre la transcripción del RNAII, reduciendo sus niveles intracelulares y favoreciendo un aumento en el número de copias plasmídicas. El cuarto capítulo plantea la caracterización de una nueva relaxasa de la familia MOBV1 y el elemento integrado (IMErpsI) de S. agalactiae que la contiene. Se demostró que el IMErpsI tiene capacidad para escindirse del cromosoma y su módulo de transferencia es funcional in vivo. La caracterización de la proteína MobSag reveló que contiene los tres motivos característicos de la familia MOBV1 en su región N-terminal y que además tiene actividad relaxasa tanto in vitro como in vivo, ya que es capaz de relajar DNA superenrrollado de un plásmido que contiene su diana (oriTIMErpsI) y mediar la transferencia conjugativa del mismo.