Aplicación de los sistemas lacasa-mediadores en la transformación de lignina. Caracterización electroquímica y nanoscópica de la enzima con fines biotecnológicos

Resumen

El presente trabajo se enmarca dentro de la línea de investigación: Biodegradación/biotransformación de ligninas industriales y naturales por microorganismos, perteneciente al Departamento de Microbiología y Biología Celular, cuyos objetivos se centran en el análisis del potencial ligninolítico de los hongos, concretamente de los ascomicetos, con el fin de estudiar sus mecanismos enzimáticos y las modificaciones químicas producidas en los sustratos, de cara a su posible aplicación biotecnológica y medioambiental. Considerando los comentarios realizados, los objetivos de este trabajo son los siguientes: Profundizar en el estudio de los sistemas lacasa-mediador aplicados en la biotransformación de una lignina, tomando como mediador modelo el ABTS, uno de los sustratos de lacasa mejor caracterizados. Caracterización electroquímica y selección de diversos compuestos mediadores y potenciadores de lacasa y determinación de su eficiencia catalítica en la oxidación de un compuesto no fenólico modelo de lignina y de una lignina de kraft. Optimización de la producción de la actividad lacasa de Fusarium proliferatum en cultivos líquidos, para su utilización, junto con los compuestos previamente seleccionados, en los sistemas LMS destinados a la biotransformación de una lignina. Estudiar las características de los procesos de transferencia directa de electrones entre la lacasa y diferentes clases de electrodos y caracterización nanoscópica de la enzima adsorbida en dichas superficies. Atendiendo a todos los resultados acerca del tratamiento de la KL en los sistemas utilizados en este estudio, se ha comprobado que la lacasa producida por Fusarium proliferatum produce un inmediato efecto oxidativo sobre la lignina a tiempo 0. A las 48 horas de incubación en ausencia de mediador, el efecto predominante es una intensa polimerización acompañada simultáneamente de una ligera despolimerización. En presencia del ABTS, el sistema LMS genera una lignina con un alto grado de oxidación y provoca su fragmentación. Todo ello aporta una información que tiene interés para facilitar el uso biotecnológico potencial de las ligninas residuales, en diversos campos industriales y medioambientales. Los diferentes compuestos sustratos de lacasa pueden ser considerados mediadores o potenciadores en función de su estabilidad electroquímica. La eficiencia catalítica de estos compuestos para oxidar el VA y la KL puede ser rápidamente determinada mediante voltametría cíclica, sin emplear posterior análisis químico. HBT y acetovanillona, a pesar de no ser considerados mediadores redox, pueden ser empleados como catalizadores para la oxidación del VA y KL. Los datos electroquímicos sugieren que el ácido violúrico oxida el VA y KL mediante una transferencia directa de electrones, a diferencia de los otros compuestos tipo N-OH (HPI y HBT). El compuesto natural acetovanillona presentó valores de eficiencia catalítica superiores a los compuestos sintéticos ABTS, TEMPO y ácido violúrico, lo que representa un uso prometedor de los compuestos naturales en los procesos de deslignificación y de transformación de ligninas industriales. La mayoría de los compuestos empleados como inductores de la actividad lacasa incrementaron la producción de la enzima, obteniéndose el mejor resultado con la combinación de 2,5 xilidina y CuSO4, medio que se utilizó para la obtención de dicha enzima. La lacasa presentó una alta afinidad así como valores de constante catalítica elevadas para los compuestos naturales empleados como mediadores o potenciadores. La utilización de los compuestos naturales en los LMSs dio lugar predominantemente a reacciones de polimerización, junto con una funcionalización de la lignina, a excepción de la acetovanillona que también despolimerizó la KL. Por el contrario, en los sistemas que contenían mediadores sintéticos se detectaron fenómenos de polimerización y despolimerización simultánea, así como un incremento de grupos funcionales en la KL. Estos resultados contribuyen a profundizar en el conocimiento de los mecanismos de transformación de ligninas por diversos compuestos naturales y sintéticos, de cara a su posible aplicación biotecnológica. Los procesos redox que tienen lugar en el centro activo de la lacasa pudieron ser detectados mediante análisis electroquímico. La enzima presentó un comportamiento electroquímico diferente en las dos superficies empleadas como electrodos (carbono y oro), mostrando una señal de oxidación asignada al centro T1 en carbono, mientras que en oro reveló hasta dos señales de oxidación atribuidas a los centros T1 y T2. La actividad electrocatalítica en ambos electrodos fue también distinta, de forma que los electrodos de carbono modificados con lacasa resultaron ser eficaces para la electrooxidación de sustratos de la enzima, así como para la electroreducción del oxígeno. Tanto el tipo de interacción proteína-superficie como la presencia de inhibidores de la enzima (iones OH- y óxidos) parecen ser los responsables de la inactivación de ésta cuando se adsorbe en oro. Estos resultados contribuyen al conocimiento de las reacciones redox llevadas a cabo por la lacasa y por tanto facilita su aplicación en determinados campos, como por ejemplo en el futuro desarrollo de biosensores y células de biocombustible.