Estudio de los mecanismos moleculares y celulares de la función protectora de la apolipoproteína d

Resum

ApoD es una lipocalina secretada que se ha vinculado con el envejecimiento, la degeneración y la lesión del sistema nervioso, al igual que con muchas formas de cáncer. Trabajos recientes realizados en organismos modelo tan diferentes como plantas, moscas o ratones (Sanchez et al., 2006, Charron et al., 2008, Ganfornina et al., 2008, Hull-Thompson et al., 2009, Ruiz et al., 2011) han demostrado que ApoD participa como mecanismo de supervivencia, conservado en muchas especies, en la lucha contra el estrés oxidativo en diversas situaciones. En esta tesis nos proponemos cuatro objetivos encaminados a conocer el papel protector que desempeña ApoD en varias situaciones fisiológicas y patológicas. Para llevarlos a cabo hemos usado modelos biológicos con altos niveles de estrés oxidativo y/o con gran sensibilidad al estrés. La aproximación experimental abarca los siguientes niveles de análisis: 1) ensayos de expresión génica (microarrays o qPCR arrays), 2) ensayos bioquímicos (actividad enzimática, lípidos peroxidados o niveles de dopamina), 3) cultivos celulares (líneas celulares o cultivos primarios), 4) análisis de tejido (sistema nervioso de ratón o tejido de adenocarcinoma colorrectal humano), y 5) análisis de comportamiento locomotor en el organismo completo (en el modelo experimental del ratón). Nos preguntamos además si el papel de ApoD es muy diferente en distintos tejidos o si mantiene un mecanismo de acción generalizable. Los tres primeros objetivos de este trabajo se han llevado a cabo en el sistema nervioso, un tejido esencialmente post-mitótico altamente sensible al estrés. Hemos centrado nuestro punto de mira en las células gliales que responden predominantemente a situaciones pro-oxidantes, los astrocitos, y en las neuronas especialmente sensibles a este tipo de estrés, las dopaminérgicas. El último objetivo está dedicado al estudio de ApoD en un tejido en proliferación constante y con gran tolerancia al estrés oxidativo originado por su alta tasa de producción de ROS (el cáncer colorrectal humano). De este modo hemos podido contrastar las semejanzas y diferencias que existen entre estas dos situaciones fisiológicas para contextualizar la relevancia y la repercusión de ApoD. En resumen, la presencia de ApoD en el entorno neuronal es necesaria para una adecuada protección contra el daño oxidativo dentro del sistema nervioso ya que influye en el perfil transcripcional de la respuesta temprana contra ese estrés. Hemos demostrado que ApoD altera de forma preferente el transcriptoma neuronal y oligodendroglial alterando la expresión de genes involucrados en la excitabilidad neuronal, la transmisión sináptica, la gestión de la mielina y la respuesta al estrés oxidativo (Objetivo 1). Tras observar la influencia de ApoD en una correcta respuesta glial que pudiera amortiguar la neurodegeneración relacionada con el estrés oxidativo, nos propusimos estudiar el papel de ApoD en las importantes interacciones glía-glía y glía-neurona dentro del sistema nervioso. Hemos demostrado que ApoD es secretada por los astrocitos en respuesta a un generador de ROS (el paraquat) y que desempeña un efecto beneficioso sobre la funcionalidad del sistema locomotor y, en concreto, del sistema dopaminérgico. Nuestros datos demuestran que la expresión de ApoD es inducida por la vía de señalización de JNK y funciona como un mecanismo autocrino en la protección de los astrocitos contra el estrés oxidativo. Además ApoD modula la reactividad glial, y altera la respuesta transcripcional de los astrocitos al estrés oxidativo. La adición de ApoD humana a los astrocitos de ratón promueve su supervivencia indicando la existencia de mecanismos conservados. ApoD contribuye a la estabilidad de los astrocitos y reduce su reactividad tanto in vitro como in vivo, siendo estos efectos suficientes para mejorar la funcionalidad del sistema dopaminérgico nigroestriatal (Objetivo 2). La reducción del impacto dañino observado en las neuronas de la sustancia negra, parece deberse a una combinación entre los efectos beneficiosos que aporta gozar de una glía circundante saludable y efectos directos de ApoD sobre las neuronas. Entre otros factores la glía libera ApoD al medio extracelular y ésta podría ejercer efectos directos sobre la viabilidad de las neuronas. Hemos contratado esta hipótesis y hemos comprobado que ApoD es efectiva incluso para neuronas dopaminérgicas deficientes en PINK1, que modelan la enfermedad de Parkinson y que los efectos beneficiosos de ApoD están mediados por la activación de la vía de señalización de ERK que promueve la supervivencia (Objetivo 3). Después de observar lo que sucede en el sistema nervioso, donde ApoD desempeña un papel de protección tanto sobre la glía que la produce como sobre las neuronas dañadas, pasamos a estudiar un modelo muy diferente para ver si se corroboran los efectos protectores de ApoD. Para este objetivo hemos usado tejidos de cáncer colorrectal humano y una línea celular de cáncer de colon. Ambas estrategias nos han permitido observar una correlación negativa entre la expresión de ApoD y la progresión del cáncer. Esto representa una paradoja dado que el estrés oxidativo aumenta con la progresión del cáncer. Nuestro estudio demuestra que las células cancerosas son capaces de responder a estímulos pro-oxidantes de forma que la expresión de ApoD en el tumor es baja en el estroma pero alta en el epitelio displásico. Por último, ApoD no modifica ni la tasa de proliferación ni la muerte por apoptosis en situación control, pero promueve la apoptosis en condiciones de estrés oxidativo. ApoD por tanto puede convertirse en un recurso terapéutico para promover la muerte de células cancerosas en situaciones de estrés (Objetivo 4). De todos estos resultados podemos extraer la conclusión general de que ApoD es una proteína que desempeña efectos de protección en diferentes sistemas ante el estrés oxidativo, promoviendo supervivencia en células gliales y neuronales (esencialmente post-mitóticas) pero promoviendo muerte celular en células neoplásicas sujetas a estrés oxidativo. Nuestro trabajo descubre además algunos de los mecanismos por los que esta proteína, aparentemente pleiotrópica, es capaz de controlar el balance supervivencia/muerte celular tanto en condiciones fisiológicas como patológicas de diversa índole