Papel de canales de k+ del musculo liso vascular en el control del tono y el remodelado arterial

Résumé

En este trabajo hemos empleado preparaciones de tres lechos vasculares con diferentes características: arteria aorta (arteria de conducción), arteria mesentérica (arteria de resistencia) y arteria femoral, que presenta propiedades intermedias. La aorta es una arteria elástica cuya misión es distribuir la sangre a todo el sistema vascular y amortiguar los cambios de presión producidos por el impulso ventricular intermitente. Las grandes arterias, como la aorta y también la femoral, aunque tienen capacidad para la contracción y dilatación no están implicadas en la regulación de la presión y el flujo sanguíneo en condiciones fisiológicas normales. Sin embargo las arterias mesentéricas son arterias de resistencia y están involucradas tanto en la regulación de la presión arterial como en el aporte y distribución del flujo sanguíneo al intestino. Valiéndonos de VSMC de los dos tipos arteriales extremos, arterias aortas y mesentéricas, de un modelo de ratones con hipertensión esencial (BPH: Blood Pressure High) y de sus respectivos controles normotensos (BPN: Blood Pressure Normal), hemos realizado un análisis global del perfil de expresión de los canales iónicos presentes en estos tipos celulares para tratar de conocer el conjunto de canales característicos de la hipertensión en ambos lechos, así como su implicación en el control del tono vascular. Este ambicioso estudio aporta datos de enorme valor para la comprensión de las bases moleculares de alteraciones vasculares como la hipertensión. Asimismo, es de esperar que la identificación del perfil de expresión de canales iónicos específico de la hipertensión esencial, proporcione nuevas dianas moleculares para la prevención y el tratamiento farmacológico de la hipertensión esencial. Nuestros resultados reflejan una mayor complejidad en el perfil de expresión de los canales iónicos en las arterias mesentéricas. Éstas expresan con una abundancia media-alta un mayor abanico de canales iónicos, entre los que encuentran los canales Kv y KCa. En el caso concreto de los canales Kv existen diferencias muy significativas en los niveles de expresión, siendo muy bajo en arterias de conducción (en aortas), y medio-alto en arterias de resistencia (mesentéricas) lo cual está de acuerdo con su contribución al tono miogénico. Asimismo, en lo que se refiere a las variaciones en sus niveles de expresión en condiciones de hipertensión, también son muy diferentes en ambos lechos vasculares: observamos una reducción generalizada de todos ellos en aorta y sólo dos cambios (la reducción de Kv4.1 y la aparición de novo de la subunidad accesoria Kv6.3) en las arterias mesentéricas. Modulación de las corrientes Kv2 por las subunidades reguladoras Kv6.3. La disminución de la densidad de corriente Kv2 en las VSMC BPH puede explicarse en base al aumento de tamaño de las células causado por la hipertrofia. Sin embargo, hay además una disminución en la amplitud de la corriente Kv2 que no correlaciona con los niveles de expresión del mRNA del canal Kv2, puesto que no se observan diferencias entre normotensos e hipertensos en la expresión del canal Kv2.1. Sin embargo la expresión de nov del Kv6.3 en células BPH podría dar respuesta a este fenómeno, ya que está descrito que estas subunidades se asocian con canales Kv2 disminuyendo su amplitud de corriente y modificando a su vez otras propiedades cinéticas del canal. Por lo tanto, la disminución de la densidad de corriente Kv2 en células BPH no se debería a una disminución de la expresión del canal, sino a la modulación funcional negativa de la proteína del canal por su asociación con subunidades Kv6.3. Diseñamos el estudio comparativo (corrientes Kv2.1 frente a Kv2.1/Kv6.3) en células HEK transfectadas. Observamos una disminución de la amplitud de corriente en heterotretrámeros Kv2.1/Kv6.3 que ha sido previamente descrita. En lo que respecta a los cambios cinéticos, observamos un enlentecimiento de la activación. Nuestros datos indican que todas las diferencias entre las corrientes nativas Kv2 de las preparaciones BPN y BPH se pueden explicar con facilidad, asumiendo que mientras que en las VSMC de ratones BPN estas corrientes están producidas por homomultímeros Kv2.1, en las células BPH están mediadas principalmente por heterocomplejos Kv2.1/Kv6.3. Nuestra conclusión con respecto a los componentes moleculares de las corrientes Kv2 se ve también reforzada por los datos de expresión de mRNA y de proteína, y por el bloqueo funcional de las corrientes con el anticuerpo anti-Kv6.3. Nuestros hallazgos proporcionan evidencias moleculares y funcionales que apoyan las hipótesis de que la expresión de novo de la subunidad accesoria Kv6.3 (que conduce a la modulación de las corrientes Kv2) puede ser un componente activo en el desarrollo natural de la hipertensión. La gran diferencia en la expresión del gen Kcng3 que se manifestó en las VSMC de arteria mesentérica, y que no se reprodujo en el caso de las de aorta, la detección de la proteína Kv6.3 en VSMC de arteria mesentérica de BPH (y no en las de BPN), y la caracterización funcional de las corrientes Kv en células de arteria mesentérica muestran cambios que concuerdan con la presencia de canales heterotetraméricos Kv2.1./Kv6.3. Finalmente, los experimentos de bloqueo con el anticuerpo anti-Kv6.3 ponen de manifiesto un papel funcional de esta subunidad únicamente en las VSMC de animales hipertensos. Modulación de los canales BK por las subunidades reguladoras beta1. Los canales BK juegan un papel central en la regulación del tono vascular debido a su activación por aumentos locales de la [Ca2+]i (calcium sparks) por la liberación de Ca2+ desde el retículo. Estos aumentos locales de Ca2+ generan corrientes transitorias espontáneas de salida de K+ (STOCs) producidas por los canales BKCa que hiperpolarizan la célula, actuando como un sistema de retroalimentación negativo que tiende a autolimitar la vasoconstricción e impedir el vasoespasmo. En el músculo liso vascular estos canales se asocian con subunidades accesorias (BKbeta1) que modulan la afinidad por Ca2+ de lo canales BK, propiciando el acoplamiento entre los sparks de Ca2+ y las corrientes espontáneas de salida de K+. En este estudio mostramos que existe una disminución en los niveles de expresión del mRNA de las subunidades BKbeta1 y BK de las VSMC de BPH y el estudio funcional revela una disminución de la amplitud de las corrientes BK y lo que es mas importante, una disminución en la sensibilidad a la modulación por Ca2+ de las corrientes en esta preparación. En el momento actual estamos diseñando y realizando estudios más detallados para confirmar el papel fisiológico de los canales BKCa en nuestro modelo, así como su contribución al desarrollo de la hipertensión. Sin embargo, los datos preliminares obtenidos que presentamos en este trabajo son consistentes con los datos previos existentes en la literatura, y nos permiten sugerir que la disminución aparente de la sensibilidad a Ca2+ de los canales BK en los animales hipertensos está asociada a la disminución en la expresión de la subunidad BKbeta1 en las VSMCs de estos ratones BPH y que esta modificación puede contribuir a explicar la hipertensión moderada detectada en estos animales. REMODELADO DE CANALES DE K+ Y SUS IMPLICACIONES PARA LA PROLIFERACIÓN DEL MÚSCULO LISO EN UN MODELO ANIMAL DE HIPERPLASIA DE LA ÍNTIMA. Hemos realizado un estudio exhaustivo del perfil de expresión de los canales iónicos en las VSMC de arteria femoral, con el objetivo de averiguar qué canales se asocian con el cambio fenotípico de las VSMC en este lecho vascular. Para ello hemos usado arrays Taqman de baja densidad, con lo que podemos obtener medidas simultáneas de casi un centenar de genes, consiguiendo así una visión global de la expresión de canales iónicos en nuestra preparación. La aproximación inicial ha sido la extracción de la información de estas bases de datos, localizando genes con una expresión diferencial significativa en las condiciones experimentales utilizadas (VSMC contráctiles frente a sintéticas). Esta caracterización se ha realizado mediante un análisis cluster, que nos proporciona un punto de vista más global para poder entender mejor el proceso de desdiferenciación. Se aporta un nivel adicional de filtrado de los datos utilizando dos modelos distintos de fenotipo proliferativo, los modelos in vivo e in vitro. La comparación de estos dos conjuntos de datos puede ayudar a identificar los cambios conservados en la expresión de genes requeridos para la proliferación de las células. Expresión de los canales iónicos en los modelos de proliferación in vivo e in vitro. Las conclusiones de los sucesivos niveles de análisis de la expresión de los canales iónicos en estas preparaciones proporcionan una información muy interesante, que podemos concretar en los siguientes aspectos: ¿ Se han caracterizado los cambios en el perfil de expresión de canales iónicos asociados con el fenotipo sintético en dos modelos de estudio. Los datos obtenidos muestran una relativa buena correlación entre los cambios observados en las dos situaciones. Considerando el modelo de proliferación in vivo, encontramos cambios en 34 genes de canales, 27 de los cuales mostraron la misma variación en VSMC en cultivo. Cuando realizamos el análisis estadístico con la corrección FDR que toma en consideración la variabilidad inherente al estudio de un gran número de datos en medidas repetidas, el número de genes que se modifican con la proliferación de forma estadísticamente significativa se reduce de 34 a 22 en la lesión endoluminal. De estos 22 genes que cambian en la lesión endoluminal, 18 mostraron el mismo cambio en las células en cultivo. Las comparaciones entre los dos modelos proliferativos y los análisis estadísticos realizados con las herramientas de la expresión diferencial de genes del programa GEPAS, nos proporcionaron un nivel adicional de confianza a nuestros resultados, ya que se reduce el número de genes de canales que muestran cambios significativos con la proliferación a 16 de los 90 genes de canales incluidos en el estudio. Solo para algunos de los canales destacados por nuestro estudio se ha descrito previamente un papel en la proliferación de las VSMC en otras preparaciones. El hallazgo de genes conservados en distintas preparaciones es importante y puede reflejar asociaciones obligatorias de algunos genes de canales iónicos con remodelado vascular, pudiendo tener una repercusión clínica importante ya que representarían una diana terapéutica específica para las patologías vasculares asociadas a la proliferación del músculo liso vascular. Contribución funcional de los canales Kv1.3 y su papel en la proliferación de las VSMC. Se ha estudiado la expresión funcional y su contribución a la proliferación de las VSMC, de los genes cuya expresión aumenta tras el cambio fenotípico (Kv1.3 y Kvbeta2). El estudio funcional se ha enfocado principalmente a los canales Kv1.3, ya que las subunidades Kvbeta2 pueden actuar como proteínas chaperonas que promueven y/o estabilizan la expresión en la superficie celular de los canales de K+ y siendo el Kv1.3 la subunidad Kv1 mas abundante en las VSMC en cultivo, parece plausible considerar que el aumento de la expresión de las subunidades Kv1.3 y Kvbeta2 esta relacionada con el hecho de que forman heteromultímeros. Nuestros datos demuestran un aumento de la expresión de ambas proteínas (Kv1.3 y Kvbeta2) en las lesiones proliferativas y también una mayor contribución de las corrientes Kv1.3 a las corrientes totales de salida en las VSMC en cultivo. El aspecto más relevante es que además hemos establecido una conexión entre la expresión funcional de los canales Kv1.3 y el fenotipo sintético, ya que la inhibición de las corrientes Kv1.3 usando bloqueantes selectivos para el canal se traduce un una disminución significativa de la migración y proliferación de las VSMC de arteria femoral en cultivo. Está ampliamente documentado que el bloqueo selectivo de los canales Kv1.3 inhibe la migración y la proliferación de los linfocitos T efectores activados. De hecho, estos bloqueantes se han utilizado con éxito para el tratamiento en modelos experimentales de esclerosis múltiple. Asimismo, también se ha descrito la participación del canal Kv1.3 en los procesos de proliferación de otros tipos celulares. Con esta perspectiva, nuestros datos proporcionan evidencias de un papel similar de los canales Kv1.3 en el cambio fenotípico de las VSMC, lo que sugiere que este nuevo papel de los canales Kv1.3 puede ser una función conservada en distintos lechos vasculares, aportando una nueva diana terapéutica para la prevención y el tratamiento de la hiperplasia de la íntima. Amberg, G. C., Bonev, A. D., Rossow, C. F., Nelson, M. T., & Santana, L. F. (2003). Modulation of the molecular composition of large conductance, Ca(2+) activated K(+) channels in vascular smooth muscle during hypertension. J Clin.Invest 112, 717-724. Beeton, C., Wulff, H., Standifer, N. E., Azam, P., Mullen (2006). Kv1.3 channels are a therapeutic target for T cell-mediated autoimmune diseases. Proc Natl.Acad.Sci U S.A 103, 17414-17419. Brenner, R., Perez, G. J., Bonev, A. D., Eckman, D. M., Kosek, J. C., Wiler, S. W., Patterson, A. J., Nelson, M. T., & Aldrich, R. W. (2000). 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