Síntesis química y enzimática de biofenoles lipofilos del olivo con actividad antiinflamatoriaoptimización de la reacción de Krapcho

Resumen

En la presente Tesis Doctoral se ha realizado la síntesis de una serie de compuestos lipófilos, a partir de biofenoles contenidos tanto en la hoja de olivo como en el aceite de oliva virgen extra (AOVE), bajo la hipótesis general de que un aumento del carácter lipófilo tiene como consecuencia una mejora en la actividad biológica del compuesto, ya que en sistemas biológicos reales se producen procesos de absorción a través de membranas celulares de naturaleza lipófila. El cumplimiento de esta hipótesis nos llevaría a la conclusión de que una mayor lipofilia de un biofenol implica una mejor biodisponibilidad y una mayor eficiencia a la hora de ejercer la acción terapéutica. Concretamente, las transformaciones descritas en esta Tesis Doctoral encaminadas a tal fin se han llevado a cabo mediante procedimientos químicos o enzimáticos, o bien mediante una combinación de ambos. En primer lugar, se ha puesto a punto un nuevo método de síntesis del fenol 3,4-dihidroxifenilglicol (DHPG), compuesto natural minoritario contenido en el AOVE, a partir de cloruro de fenacilo en 3 pasos y con un rendimiento global del 38% mediante de una ruta sintética sencilla y fácilmente escalable. En segundo lugar, la síntesis de las dos nuevas familias de derivados lipófilos 10-14 y 23-27, se ha realizado mediante esterificación con ácidos carboxílicos de 2 a 16 átomos de carbono a partir de los catecoles O-bencil protegidos 4 y 17, derivados DHPG y de HT, respectivamente. En tercer lugar, se ha establecido la utilidad sintética de nuevos extractos enzimáticos procedentes de microorganismos con marcada actividad en reacciones de transesterificación en compuestos fenólicos y carbohidratos modelo, concluyendo que los mejores resultados se obtienen por la vía de la desacilación, que resulta ser muy selectiva. Gracias a ello, se ha logrado la síntesis de HTAc 29 a partir del derivado triacetilado de HT 142, y de una nueva familia de compuestos lipófilos del DHPG 30-39 a partir del derivado tetraacetilado 2. Esta familia se caracteriza por exhibir el grupo catecol desprotegido y por la sustitución en posición bencílica de un grupo acetoxi por un grupo alcoxi que proviene del alcohol utilizado como disolvente en la etapa de desacilación. Adicionalmente, en la desacilación de disacáridos peracetilados como la trehalosa y la sacarosa, se ha observado una preferencia por la desacilación selectiva de uno de los monosacáridos dejando el segundo inalterado, permitiendo así la desimetrización de la trehalosa y el acceso a nuevos derivados como el penta-O-acetilado 42 y el tetra-O-acetilado 43 en solo dos pasos: peracilación seguido de desacilación regioselectiva. Finalmente, la desacilación selectiva del ligstrósido y la oleuropeína peracetilados 147 y 148 con estos extractos enzimáticos ha permitido la síntesis regioselectiva de los compuestos 49 y 50, acetilados únicamente en el anillo de glucosa. Utilizando una lipasa comercial (Thermomyces lanuginosus) ha sido posible la acilación regioselectiva de la posición 6 de la glucosa de la oleuropeína con acilos de 2, 4, y 8 carbonos con rendimientos aceptables (56‒74%). En cuarto lugar, algunos de los derivados sintetizados han sido ensayados en diferentes modelos de inflamación. De este modo, el glicol 3 y el HTAc 29 han demostrado ser eficientes moduladores de la respuesta inflamatoria de macrófagos peritoneales estimulados con LPS, consiguiendo modular el nivel de nitritos y la expresión de enzimas proinflamatorias en la célula. Más aún, el derivado 29, ha demostrado ser un excelente agente terapéutico en enfermedades de índole inflamatoria como la colitis ulcerosa, la artritis reumatoide y el lupus eritematoso sistémico, combatiendo la inflamación y corrigiendo el nivel de estrés oxidativo asociado a estas patologías. Siguiendo esta tendencia, estudios preliminares con macrófagos peritoneales señalan que los derivados lipófilos de la oleuropeína tienen un efecto similar al alcanzado por el HTAc 29. Tanto el peracetilado de la oleuropeína 148, como los derivados parcialmente acilados obtenidos enzimáticamente, el tetraacetilado 50 y el monoacetilado 46, son mejores que la oleuropeína, en cuanto a la modulación de la respuesta inflamatoria y el nivel de estrés oxidativo de macrófagos peritoneales. En quinto lugar, se ha optimizado la reacción de desmetoxicarbonilación de Krapcho aplicada a la oleuropeína para obtener con rendimiento aceptable la oleaceína acetilada o aceoleína 51 junto con el aglicón del oleurósido deshidratado (DOA) acetilado 52, mediante calentamiento a 150 ºC en DMSO seguido de acetilación y sin purificación previa. Esta misma estrategia biomimética ha podido ser implantada en extractos fenólicos del aceite de oliva conteniendo los aglicones monoaldehídicos de ligstrósido y oleuropeína 65 y 66, así como con los mismos aglicones purificados por separado, lo que permite no solo un nuevo acceso a oleocantal y oleaceína, sino también la posibilidad de enriquecer extractos fenólicos fáciles de obtener de AOVEs en oleocantal y oleaceína, dos compuestos de alto valor añadido y con aplicación en la industria Farmacéutica y de la Alimentación. Se han explorado diferentes vías de estabilización de la oleaceína con el objetivo de posibilitar su purificación cromatográfica, obteniéndose de esta manera el ya citado derivado acetilado de la oleaceína 51 y también los compuestos derivados de las reducciones regioselectivas 59 y 60, además de los monoacetales 61‒64. Los compuestos acetilados 51 y 52 que resultan de la reacción de Krapcho sobre la oleuropeína y posterior acetilación han sido ensayados, junto con los derivados lipófilos de ligstrósido 49 y 147, y de oleuropeína 50-52 y 148 como agentes antiproliferativos frente a diversas líneas celulares de tumores sólidos humanos. Los resultados muestran una progresiva mejora de los datos de inhibición de crecimiento celular conforme aumenta la lipofilia de los glucósidos secoiridoides. Además, tanto 51 como 52 presentan mejores resultados que el HT peracetilado en todas las líneas celulares ensayadas. En los compuestos con mejores actividades, se observa una mayor selectividad hacia las células de cáncer cérvico-uterino (HeLa) con GI50 de (8.6 ± 4.4) μM, (23 ± 4.3) μM y (15 ± 3.2) μM para 148, 51 y 52 respectivamente. Finalmente, se ha propuesto un método de cuantificación mediante 1H-RMN de los derivados aldehídicos de naturaleza secoiridoide presentes en la fracción fenólica de AOVEs, con el que se consigue la cuantificación de oleaceína 53, oleocantal 57 y los aglicones monoaldehídicos de ligstrósido 65 y oleuropeína 66 mediante la integración de las señales de los protones aldehídicos por encima de 9.0 ppm.